Rôles des voies MAPK et Rac dans la transition épithélium-mésenchyme des cellules NBT-II activée par Ras

Roles of MAPK and RAC pathways during the RAS-induced epithelial to mesenchymal transition of NBT-II cells

• Auteur / Autrice : Natacha Edme
• Direction : Brigitte Boyer
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie
• Date : Soutenance en 2001
• Etablissement(s) : Paris 11

Résumé

La transition épithélium-mésenchyme (TEM) correspond à la perte du phénotype épithélial des cellules avec internalisation de leurs jonctions intercellulaires et à l'acquisition d'un phénotype fibroblastique avec acquisition de mobilité cellulaire. Le facteur de croissance épithélial (EGF) induit la TEM des cellules de carcinome vésical de rat NBT-II par une voie de signalisation dépendant des protooncogènes Ras et Src. Ras est une GTPase connue pour avoir plusieurs d'effecteurs, dont c-Raf qui active la voie MAPK, la PI3K, Ra1GDS, Rac. L'objectif de ce travail de thèse a été de déterminer quels sont les effecteurs de Ras activant la TEM. Par différentes approches, nous avons pu montrer que parmi tous les effecteurs de Ras, ce sont c-Raf et Rac qui jouent un rôle essentiel. En effet, l'inhibition de la voie qu'ils activent ou de leurs activités propres aboutit au blocage de la TEM induite par Ras ou par l'EGF. Bien que MEK1, un composant de la voie des MAPK et Rac1 pris isolément, ne soient pas suffisants pour induire la dispersion des cellules NBT-II, la coactivation de ces deux facteurs induit la TEM des cellules NBT-II. La migration des cellules induite par l'EGF ou Ras n'est pas inhibée par l'inhibiteur de la PI3K, ce qui indique que la PI3K ne participe pas à l'activation de la migration des cellules NBT-II. Afin de confirmer que Rac est le signal inducteur de la migration des cellules NBT-II, nous avons étudié les mécanismes d'activation de Rac dans les cellules NBT -II. L'EGF et la surexpression stable ou transitoire d'une forme active dominante de Ras induit l'activation de Rac. De plus, les mutants actifs de MEK1 et p110 n'activent pas Rac et l'inhibition de chacune de ces 2 voies ne bloque pas l'activité Rac induite par Ras ou l'EGF. D'une part, ces résultats suggèrent que l'activation de Rac par l'EGF et par Ras ne dépend pas des voies MAPK et PI3K et d'autre part, ils confirment que la voie PI3K ne participe pas à la migration cellulaire induite par Rac.

Cell dissociation and cell migration are two main components of epithelium- mesenchyme transitions (EMT). We have previously demonstrated that Ras is required in the accomplishment of both of these during the EGF-induced EMT of the NBT-II rat carcinoma cell line in vitro. In this study, we examined the downstream targets of Ras responsible for the dissociation and motility of NBT -II cells. Overexpression of activated forms of c-Raf and MEK1 (a component of the Mitogen Activated Protein Kinase pathway, MAPK), led to cell dissociation as inferred by the loss of desmosomes from the cell periphery. In contrast, active PI3K, Ra1A and Ra1B did not induce desmosome breakdown. The MEK1 inhibitor PD098059 inhibited EGF- and Ras-induced cell dispersion whereas the PI3K inhibitor LY294002 had no effect. Accordingly, among the partial loss of function mutants of Ras (RasV12) that distinguish between downstream targets of Ras, we found that the Raf-specific Ras mutants RasV12S35 and RasV12E38 induced cell dissociation. The PI3K- and Ra1GDS-activating Ras mutants had in contrast no effect on cell dispersion. However, MEK1 was unable to promote cell motility, whereas RasV12S35 and RasV12E38 induced cell migration, suggesting that another Ras effector was responsible for cell motility. We round that the small GTPase Rac is necessary for EGF-mediated cell dispersion since overexpression of a dominant-negative mutant of Rac1 (Rac1N17) inhibited EGF-induced NBT-Il cell migration. All stimuli that promoted cell migration also induced Rac activation. Finally, coexpression of active Rac1 and active MEK1 induced the motility of NBT-II cells suggesting that Ras mediates NBT-II cell scattering through the coordinate activation of Rac and Raf/MAPK pathways.