Analyse fonctionnelle du méga-plasmide pSOL1 de Clostridium acetobutylicum ATCC824 : de la séquence à la caractérisation du rôle physiologique

Functional analysis of the megaplasmid pSOL1 from Clostridium acetobutylicum ATCC824 : from the sequence to the caracterization of the physiological role.

• Auteur / Autrice : Lisa Fontaine
• Direction : Philippe Soucaille
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie - Santé. Biotechnologie
• Date : Soutenance en 2001
• Etablissement(s) : Toulouse, INSA

Mots clés

Mots clés contrôlés

Métabolisme

Solvants

Plasmides

Aldéhyde-déshydrogénases

Alcool déshydrogénase

Hydrogénases

ADN extrachromosomique

Transcription génétique

Génétique microbienne

Résumé

Clostridium acetobutylicum est une bactérie sporulante, strictement anaérobie et capable de produire des solvants (acétone et butanol). Cette bactérie possède un méga-plasmide de 192 kpb, nommé pSOL1, impliqué dans cette production de solvants et dans la sporulation. La séquence nucléotidique de pSOL1 étant disponible, la caractérisation des fonctions des gènes codés par ce méga-plasmide, en particulier ceux impliqués dans la production de solvants, a été entreprise. L'annotation de la séquence de pSOL1 a été effectuée. Afin d'identifier les gènes spécifiquement exprimés ou réprimés lors des différents métabolismes acidogène (production d'acides acétique et butyrique), solvantogène (production d'acétone et de butanol) et alcoologène (production majoritaire de butanol et d'éthanol), une cartographie de transcription des différents gènes potentiels (ORFs) portés par pSOL1 dans ces trois conditions physiologiques a été réalisée. L'analyse de l'expression différentielle des gènes portés par pSOL1 a mis en évidence des gènes potentiellement impliqués dans les métabolismes solvantogène et alcoologène de C. Acetobutylicum. Ces données ont permis la caractérisation du gène adhE2, gène codant pour une deuxième aldéhyde/alcool déshydrogénase impliquée dans la production de butanol, non couplée à celle d'acétone, ainsi que l'étude de hupS,L,D,Q3,Q4,hypF, opéron codant pour une [NiFe] hydrogénase, potentiellement impliquée dans le métabolisme primaire via la distribution du flux d'électrons. Ces études ont permis le développement de souches recombinantes par ingénierie métabolique. Le clonage de la région minimale de réplication du méga-plasmide et sa caractérisation ont été effectués. L'intégration des données physiologiques et génétiques obtenues apporte des éléments de réponse à la description des réseaux complexes de régulation qui conduisent C. Acetobutylicum à se différencier et à produire des solvants.

Clostridium acetobutylicum is a strictly anaerobic spore forming bacteria able to produce solvents (acetone and butanol). This bacteria contents a megaplasmid (192 kpb), referred as pSOL1, that is involved in the solvent production and the spore formation. The nucleotide sequence of pSOL1 being available, we started to characterize the functions encoded by the genes carried by pSOL1, especially those playing a role in the solvent production. The sequence annotation of pSOL1 was carried out. In order to identify the genes specifically expressed or repressed during the acidogenic (productions of acetic and butyric acids), solventogenic (productions of acetone and butanol) and alcohologenic (production mainly of butanol an ethanol) metabolisms, we performed the transcription maps of the potential genes (ORFs) carried by pSOL1 in these three physiologic conditions. The analysis of the differential expression of the genes of pSOL1 had revealed several genes potentially involved in the solventogenic and alcohologenic metabolisms of C. Acetobutyilcum. This data allowed us to identify adhE2, a gene encoding for a second aldehyde/alcohol deshydrogenase involved in the production of butanol (non-coupled to acetone production). Furthermore, we also studied hupS,L,D,Q3,Q4,hypF, an operon encoding for a [NiFe] hydrogenase, potentially involved in the primary metabolism via the electron flux distribution. Moreover, our investigation allow the development of recombinant strains by metabolic engineering. We have also cloned and characterized a minimal region responsible of the pSOL1 replication. The combination of the physiologic and genetic data obtained in our study bring new insights for the description of the complex regulatory networks leading C. Acetobutylicum to differentiate and produce solvents.