Création de banques d'ADN de micro-organismes telluriques, sans étape préalable de culture in-vitro

• Auteur / Autrice : Sophie Courtois
• Direction : Pascal Simonet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences
• Date : Soutenance en 2000
• Etablissement(s) : Lyon 1

Mots clés

Mots clés contrôlés

Lindane

ARN ribosomique 16S

Sols -- Microbiologie

ADN bactérien

Diversité bactérienne

Banques de gènes

Résumé

De recentes avancees en ecologie microbienne moleculaire ont demontre que moins de 1% des micro-organismes colonisant des ecosystemes tels que le sol ou les milieux aquatiques pouvaient etre isoles sur milieux de culture. Afin d'exploiter ce potentiel et de mieux apprehender la diversite physiologique des bacteries de l'environnement, l'approche privilegiee dans cette etude a consiste a faire exprimer dans un hote domestique l'information genetique contenue par ces micro-organismes. Nos objectifs etaient triples, visant a demontrer la possibilite de generer de telles banques, a confirmer que les fragments clones permettaient d'aborder la microflore non cultivee, et enfin a demontrer que cette information genetique pouvait effectivement s'exprimer chez ces hotes heterologues. En amont, des methodes d'extraction d'adn a partir d'echantillons de l'environnement ont ete adaptees afin d'extraire des fragments d'adn en quantite et qualite compatibles avec des etapes de clonage. Ainsi, des outils ont ete developpes, permettant l'extraction de fragments d'adn superieurs a 600 kb, et en controlant les biais d'extraction pouvant fausser la diversite de l'adn a cloner. Le clonage d'un gene codant pour une enzyme responsable de la degradation d'un pesticide, le lindane, a permis de demontrer l'expression d'une activite enzymatique chez un hote heterologue, a partir d'adn directement extrait d'un echantillon de sol. En vue de l'expression de metabolites secondaires originaux, une banque cosmidique portant des inserts de 20 a 40 kb a ete construite chez e. Coli. La diversite phylogenetique, etudiee au travers du marqueur arnr16s, a montre qu'une banque ainsi construite contenait des genes provenant non seulement de micro-organismes diversifies phylogenetiquement, mais surtout de micro-organismes n'ayant jamais ete identifies ou cultives jusqu'a ce jour.