Purification, proprietes et mecanisme d'action d'une pectine methylesterase de pomme (malus domestica cv. Golden delicious). Influence des traitements hautes pressions isostatiques sur son activite

• Auteur / Autrice : JEAN-MARC DENES
• Direction : Jean-François Drilleau
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie
• Date : Soutenance en 1999
• Etablissement(s) : Rennes 1

Résumé

Ce travail a pour objectif d'etudier la pectine methylesterase (pme) de pomme, enzyme participant a la destabilisation des jus troubles. La pme est purifiee a partir du parenchyme, en utilisant une technique de chromatographie d'affinite, sur gel greffe avec un inhibiteur de pme extrait du kiwi. Dans les conditions standard (ph 7,0 ; 35\c ; nacl = 0,1 m ; pectine de pomme skw a 2,5 g. L - 1), l'activite specifique de l'enzyme pure est de 12,07 nkat. G - 1 proteine. Les etudes cinetiques, a vitesse initiale, permettent de preciser ses caracteristiques optimales d'action (ph = 7,5 a 9,0 ; 62 \c ; nacl = 0,15 m) et de determiner les valeurs des constantes (km = 0,039 g. L - 1 ; vmax = 12,25 nmol. S - 1. G - 1 proteine). Un modele explicatif des cinetiques de l'enzyme au cours du temps est elabore. Celui-ci prend en compte l'inhibition de l'enzyme par les produits de la reaction et l'existence d'une fraction de substrat non accessible (encombrement sterique, ionisation de la pectine et / ou de la proteine). Le modele s'ajuste correctement aux points experimentaux des cinetiques (0,988 < r 2 < 0,997) a differents ph, a differentes concentrations et differents degres de methoxylation initiaux du substrat. L'analyse des produits reactionnels, par chromatographie liquide haute performance et par rmn du proton, demontre que la pme de pomme agit differemment selon le ph. Elle attaque le substrat selon un mecanisme monochaine par attaque multiple a ph 7,0 et selon un mecanisme intermediaire entre monochaine et multichaine par attaque multiple a ph 4,5. Le degre d'attaque multiple de l'enzyme (10 a 11) est le meme aux deux ph mais semble dependant du nombre moyen de groupements acides galacturoniques methoxyles successifs sur le substrat. La pme est une enzyme baroresistante. In vitro, l'activite est preservee a 50% apres un traitement de 650 mpa a 20 \c. Dans le jus de pomme, l'activite residuelle est paradoxalement plus elevee lorsque le traitement hautes pressions isostatiques (hpi) est plus important (pression ou duree).