Etude de la secretion de la pullulanase chez escherichia coli

• Auteur / Autrice : Nathalie Sauvonnet
• Direction : Anthony Pugsley
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1998
• Etablissement(s) : Paris 7

Résumé

La pullulanase (pula) est une lipoproteine amylolytique de 116 kda secretee par la voie generale de secretion (vgs) de klebsiella oxytoca. La secretion se deroule en deux etapes : d'abord, le passage a travers la membrane cytoplasmique par le systeme sec puis la translocation de pula repliee a travers la membrane externe impliquant 14 facteurs pul. La vgs est un mecanisme de secretion tres repandu, cependant sa seconde etape est tres peu comprise. En particulier la localisation et la nature du signal de secretion des proteines empruntant la vgs, et la necessite d'une conformation precise de ces dernieres pour leur translocation sont des enigmes que j'ai entrepris de resoudre dans le cas de la pullulanase. Nous avons adopte une strategie de deletion aleatoire dans pula en contexte de proteine hybride avec comme rapporteur, la -lactamase (blam). Grace a blam nous disposions d'un crible simple pour distinguer et conserver seulement les formes tronquees de pula-blam toujours secretees ; ceci nous a permis d'isoler deux regions a et b, longues de 78 et 80 acides amines respectivement, qui sont toutes deux suffisantes et essentielles pour la secretion de deux rapporteurs (blam et une cellulase) et de la pullulanase complete. Ainsi, ces deux regions constituent bien le signal de secretion de pula. La seconde thematique de mon projet de these portait sur l'etude de la conformation des enzymes avant leur secretion par la vgs. Il avait ete montre, auparavant, que la cinetique de secretion de la pullulanase etait dependante d'une disulfide oxydoreductase, dsba, suggerant alors que les ponts disulfures intramoleculaires de pula etaient necessaires pour sa translocation. Afin d'examiner clairement le role de ces structures, nous avons remplace independamment les six cysteines de pula en serines mais ces nouveaux variants etaient aussi bien secretes que la forme sauvage. La creation d'une forme de la pullulanase sans cysteine nous a permis de montrer que ces ponts n'etaient pas impliques dans la secretabilite de l'enzyme. En comparant la cinetique de translocation de pula avec ou sans pont disulfure et dans une souche produisant ou non dsba, nous avons alors observe que cette disulfide oxydoreductase etait impliquee dans la secretion par les facteurs pul independamment de la formation de ponts disulfures dans la pullulanase.