Reactivite chimique de l'adn comme diagnostic de ses proprietes conformationnelles associees a sa fonction biologique : etude de l'interaction entre la proteine intronique i-sce1 et sa cible nucleique

by BENEDICTE BEYLOT

Doctoral thesis in Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Under the supervision of ANNICK SPASSKY.

defended on 1998

in Paris 6 .

  • Alternative Title

    Chemical reactivity of dna as conformational feature in relation with its biological function : analysis of the interaction between the intronic protein i-scei and its nucleic target


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  • Abstract

    La proteine i-scel, codee par l'intron optionnel lsu de s. Cerevisiae, est la premiere endonuclease decouverte impliquee dans la mobilite intronique, appartient a une classe d'endonucleases contenant le motif lagli-dadg et reconnait specifiquement une longue sequence de 18 paires de bases qu'elle coupe en presence de metal divalent, liberant deux extremites sortantes 3-oh de 4 bases. La stringence de l'interaction pose la question cruciale de la reconnaissance dynamique d'une longue sequence d'adn par une petite proteine (235 acides amines) et doit impliquer un contenu informatif important tant de la sequence d'adn que des residus proteiques. Nous avons mis au point sur gel retard, les conditions de stabilisation (taille du fragment d'adn, temperature, force ionique) d'un complexe specifique proteine i-scei-adn en absence de metal divalent. La structure du complexe a ete analysee par la methode hautement resolutive d'empreinte moleculaire (sondes enzymatique et chimiques). La complexation de la proteine sous forme monomerique induit une deformation considerable de sa sequence cible au niveau du site de coupure (petit sillon). De plus, deux sites de distortion helicale sont caracterises de part et d'autre du site de coupure et des contacts adn-proteine s'etablissent dans le petit sillon a un tour d'helice en aval du site de coupure. L'intimite de l'interaction diminue d'aval vers l'amont. Nous avons mis au point des conditions experimentales permettant de suivre la dynamique des changements conformationnels de l'adn (une impulsion laser tres breve, de l'ordre de la picoseconde). De cette attaque resulte, en particulier, la formation de lesions oxydatives au niveau des guanines, dont l'identification et la quantification a conduit a la premiere empreinte photonique. De plus, l'analyse des lesions par extension d'amorces nous a permis d'identifier deux sites de l'adn contactant la proteine dans le complexe en absence de metal divalent. Cette methode pourra ensuite etre utilisee pour analyser les changements conformationnels au cours du processus conduisant a la coupure de l'adn. L'analyse cinetique du complexe en absence et en presence de metal divalent montre sans aucune ambiguite, que la double coupure resulte en fait, d'un processus sequentiel. De plus, la proteine reste liee au produit de coupure aval. Les resultats sont discutes en relation avec le contenu informatif intrinseque de l'adn resultant de precedentes etudes et avec les structures cristallographiques recentes de proteines introniques de la meme famille.

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Informations

  • Details : 223 P.
  • Annexes : 313 REF.

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