Étude structurale par résonance magnétique nucléaire et modélisation moléculaire de la MBP, une métalloprotéine de synthèse conçue à partir de deux protéines naturelles : la charybdotoxine et l'anhydrase carbonique b

Structural study by nuclear magnetic resonance and molecular modeling of MBP, a synthetic metal binding protein designed from two naturalproteins: charybdotoxin and carbonic anhydrase b

• Auteur / Autrice : CAROLE LEON
• Direction : N. PLATZER
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1996
• Etablissement(s) : Paris 6

Résumé

Le controle de la fonction et de la structure des produits synthetiques est une des etapes principales lors de la conception de nouvelles molecules en chimie et en biochimie. En particulier, pour la chimie des proteines, le but est d'obtenir des entites bioactives, dont la structure et la fonction seraient predeterminees. Dans ce but, le transfert d'un site de liaison aux metaux, sur la plate-forme d'une proteine qui en est naturellement depourvue, se presente comme particulierement attractif, car un tel site peut etre rapidement et completement caracterise par diverses methodes spectroscopiques, qui permettent d'evaluer l'efficacite du transfert. Une nouvelle metalloproteine, appelee mbp (pour metal binding protein), a ete obtenue en inserant le site de liaison au zn#2#+, tel qu'il existe dans l'anhydrase carbonique humaine de type b, sur la plate-forme d'une toxine de scorpion, la charybdotoxine. Apres synthese par voie chimique et purification de la proteine chimerique, nous avons entrepris l'etude structurale de la mbp selon une methode classique: etude par rmn multidimensionnelle conduisant a un certain nombre de contraintes utilisees par des protocoles de modelisation moleculaire. Cette etude nous a permis d'obtenir la structure tridimensionnelle en solution de la mbp dans differentes conditions experimentales: a ph - 3,5, puis a ph = 6,3, en absence et en presence de metal. L'examen de la structure de l'apo-mbp obtenue a ph = 3,5, et sa comparaison avec la structure de la charybdotoxine, montre que le repliement global n'a pas ete modifie, meme apres neuf mutations. La proteine chimerique possede bien le repliement de type /b, constitue d'une helice reliee a un triple feuillet b par trois ponts disulfure, caracteristique des toxines de scorpions. Deux structures ont ensuite ete obtenues a un ph de 6,3 en absence et en presence de chlorure de cadmium. Ces structures montrent que les trois histidines constituant le site de liaison introduit se trouvent, dans la structure de l'apo-mbp, en position favorable pour lier le metal. De plus, la comparaison avec le site naturel de l'anhydrase carbonique montre de grandes similitudes. Enfin, la comparaison des structures de la chimere entre elles montrent une modification du repliement au niveau de l'helice lorsque la valeur du ph augmente. Afin de completer la caracterisation du site de liaison aux metaux, des experiences de rmn heteronucleaires plus specifiques, qui concernent l'isotope 113 du cadmium, ont ete entreprises. Elles ont permis de caracteriser precisement l'environnement du metal, grace a la valeur du deplacement chimique, referencee dans la litterature. Ces donnees permettent de mettre en evidence, dans la mbp, un phenomene d'echange chimique du cadmium au niveau du site. Ce phenomene s'explique par la localisation du site en surface de la proteine synthetique, ce qui permet un echange rapide entre le cadmium lie a la proteine et le cadmium lie au solvant. L'etablissement des trois structures en solution permet de conclure que le transfert du site s'est effectue avec succes: la structure de la plate-forme de depart est conservee, et une nouvelle fonction est acquise