Etude des facteurs moléculaires responsables de la spécificité de cofacteur des déshydrogénases à NAD(P)

A Study of molecular factors responsible for the cofactor specificity of NAD(P) dehydrogenases

• Auteur / Autrice : Sophie Rahuel-Clermont
• Direction : Guy Branlant
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Enzymologie
• Date : Soutenance en 1994
• Etablissement(s) : Nancy 1
• Partenaire(s) de recherche : autre partenaire : Université Henri Poincaré Nancy 1. Faculté des sciences et techniques

Mots clés

Mots clés contrôlés

Geobacillus stearothermophilus

Mutagenèse

NAD (coenzyme)

Aldéhyde-déshydrogénases

Oxydoréductases

Coenzymes

Résumé

Nous avons utilisé la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase de type phosphorylante (GAPDH) comme enzyme modèle pour étudier la spécificité de cofacteur des oxydoréductases à NAD(P). En combinant connaissance de la structure tridimensionnelle de la GAPDH glycolytique NAD-dépendante de bacillus stearothermophilus et comparaisons de séquences primaires avec les GAPDH chloroplastiques NAD(P)-dépendantes, nous avons produit et étudié une série de mutants de la GAPDH NAD-dépendante au niveau de la liaison du NAD et du NADP. L'absence d'activité de l'enzyme de type sauvage avec le NADP proviendrait de facteurs moléculaires stériques et de la répulsion électrostatique entre le groupement 2'-phosphate du NADP et le résidu ASP32. Les triples mutations d32a-l187a-p188s (d32a-s) et d32g-l187a-p188s (d32g-s) entrainent une inversion de la spécificité de cofacteur en faveur du NADP, les enzymes mutées étant 2 et 4 fois plus efficaces avec le NADP qu'avec le NAD. Les valeurs maximales d'efficacité enzymatique et d'affinité avec le NADP sont observées pour le mutant D32G-S, mais avec un rapport K#C#A#T/K#M demeurant 33 et 55 fois inferieur a celui de l'enzyme glycolytique sauvage avec le NAD et de l'enzyme chloroplastique avec le NADP, respectivement. Les substitutions l33t-t34g-d35g sur le mutant S conduisent à une faible augmentation de l'affinité et de l'efficacité catalytique avec le NADP. D'autres déterminants structuraux de la GAPDH chloroplastique interviennent donc pour rendre compatibles la présence du 2'-phosphate du NADP avec celle de D32. L'étude du mécanisme réactionnel suggère que ces mutations provoquent un changement de l'étape limitant de la réaction, liée à une altération de la transition conformationnelle induite par la liaison du cofacteur. Ces résultats, comparés a la littérature, suggèrent que le caractère strict de la NAD-spécificité de nombreuses oxydoréductases dépend de facteurs structuraux généraux comme le résidu D32, mais aussi spécifiques à chaque enzyme, comme les déterminants de type quaternaire L187 et P188 de la GAPDH et que les modalités de liaison du NAD aux déshydrogénases à dualité de cofacteur NAD et NADP sont analogues à celles des enzymes strictement NAD-dépendantes.