Analyse de la réplication du génome humain par séquençage nanopore

Analysis of the replication of the human genome by nanopore sequencing

• Auteur / Autrice : Victoria Rojat
• Direction : Benoît Le Tallec, Diletta Ciardo
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génétique et génomique
• Date : Soutenance le 21/03/2025
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie de l'École normale supérieure (Paris ; 2010-....)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Réplication des chromosomes eucaryotes (Paris ; 20..-....)
• Partenaire(s) de recherche : Établissement de préparation de la thèse : École normale supérieure (Paris ; 1985-....)
• Jury : Président / Présidente : Olivier Espéli
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Benoît Le Tallec, Diletta Ciardo, Olivier Espéli, Marie-Noëlle Prioleau, Eric Julien, Philippe Pasero, Nataliya Petryk
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Marie-Noëlle Prioleau, Eric Julien
• DOI : 10.70675/3831eaf1z034dz4d57zb4c9zd70bdbde4938

Mots clés

Mots clés contrôlés

Génétique

Génomique

Mots clés libres

Réplication de l'ADN

Stress réplicatif

Séquençage nanopore

Molécule unique

DNA replication

Replication stress

Nanopore sequencing

Single-molecule

Résumé

Chez les eucaryotes, la réplication de l’ADN commence à partir de multiples origines activées en phase S. Chaque origine forme deux fourches de réplication divergentes qui synthétisent l'ADN. La localisation des origines dans le génome humain reste incertaine, et les facteurs qui régulent la progression des fourches sont eux aussi mal connus. Pour y remédier, notre laboratoire a développé FORK-seq, une méthode de cartographie de la réplication en molécule unique, à haut débit et à haute résolution basée sur la détection par séquençage nanopore d’un analogue de la thymidine, le bromodésoxyuridine (BrdU), incorporé pendant la réplication. FORK-seq a été utilisée avec succès chez la levure S. cerevisiae mais transposer cette approche chez l’Homme est un défi majeur car la taille du génome humain, 250 fois celle du génome de levure, décuple les coûts de séquençage et rend indispensable une stratégie d’enrichissement en signaux BrdU. J’ai donc conçu un protocole de marquage spécifique, le « multi-pulse », qui consiste à marquer les cellules avec des pulses successifs de BrdU pour démultiplier les signaux réplicatifs. En plus d’accroître le nombre de fourches détectées, le « multi-pulse » donne également accès à leur vitesse en divisant simplement la distance parcourue par une fourche par l’intervalle de temps séparant deux pulses. Les lectures nanopores les plus longues offrent même l’opportunité de suivre les fourches pendant plusieurs heures, et de voir le programme de réplication se dérouler sous nos yeux. Grâce à cette méthode, j’ai réalisé dans les cellules HCT116 la première carte réplicative du génome humain en molécule unique, positionnant plusieurs millions de fourches individuelles ainsi que des centaines de milliers d’évènements d’initiation et de terminaison. Deux pulses successifs de BrdU suffisant à estimer la vitesse des fourches de réplication, j’ai aussi mis au point le « double-pulse », ersatz simple et rapide du « multi-pulse » permettant de suivre la progression des fourches et de détecter leur ralentissement en présence de stress réplicatif.

In eukaryotes, DNA replication starts from multiple origins activated in S phase. Each origin forms two divergent replication forks that synthesize DNA. The location of origins in the human genome remains uncertain, and the factors that regulate fork progression are also poorly understood. To address these issues, our laboratory has developed FORK-seq, a high-throughput, high-resolution, single-molecule replication mapping method based on nanopore sequencing detection of the thymidine analog bromodeoxyuridine (BrdU) incorporated during replication. FORK-seq has been successfully used in S. cerevisiae, yet applying FORK-seq to human cells is a major challenge since the size of the human genome, 250 times that of yeast’s, drastically increases sequencing costs and makes BrdU signal enrichment strategies mandatory. I have therefore devised the “multi-pulse” method, which consists in labelling cells with successive BrdU pulses to increase the number of replication signals. In addition to multiplying the number of detected forks, the “multipulse” approach also gives access to fork speed by simply dividing the distance traveled by a given fork by the time interval between two pulses. The longest nanopore reads offer the unique opportunity to follow fork progression over several hours, allowing us to observe the replication program unfold right before our eyes. Thanks to the “multi-pulse” protocol, I have generated in HCT116 cells the first ever single-molecule-based replication map of the human genome, positioning millions of individual replication forks as well as hundreds of thousands of replication initiation and termination events. Since only two successive BrdU pulses are sufficient to estimate fork velocity, I have also developed the “double-pulse” protocol, a simpler and faster “multi-pulse” alternative enabling the measurement of thousands of individual fork speeds and the detection of fork slowdown induced by replication stress.