Conformational dynamics and interactions of eIF4B IDR and its phosphomimetic mutants

Dynamique conformationnelle et interactions de l'IDR de l'eIF4B et de ses mutants phosphomimétiques

• Auteur / Autrice : Pascale Sarkis
• Direction : Mikayel Aznauryan
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie
• Date : Soutenance le 11/12/2024
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Talence, Gironde ; 1993-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : ARNA Acides Nucléiques : Régulations Naturelle et Artificielle (2016-....)
• Jury : Président / Présidente : Isabel Alves
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sigrid Milles, Andrea Soranno

Mots clés

Mots clés contrôlés

Interactions ARN-protéine

Démixtion

Oligomères

Protéines intrinsèquement désordonnées

Mots clés libres

SmFRET

EIF4B

Oligomérisation

Séparation de phase

Interaction avec l'ARN

Mutants phosphomimétiques

SmFRET

EIF4B

Conformational dynamics

Oligomerization

Phase separation

Protein-RNA interactions

Phosphomimetic mutants

Résumé

Selon le paradigme structure-fonction, la fonction d'une protéine dépend de sa structure, et une connaissance approfondie de cette structure révèle des mécanismes fonctionnels essentiels. Cependant, ce paradigme est remis en question par les protéines intrinsèquement désordonnées (IDPs), qui, bien qu'elles n'aient pas de structure stable, restent fonctionnelles. Le facteur d'initiation de la traduction eucaryotique 4B (eIF4B) est une IDP clé dans la régulation de l'initiation de la traduction chez les eucaryotes. Cofacteur essentiel de l'hélicase eIF4A, eIF4B est crucial pour la traduction des ARNm dotés de longues régions 5' non traduites structurées. Il possède plusieurs domaines fonctionnels, dont le domaine structuré du motif de reconnaissance de l'ARN (RRM) en N-terminal, la région désordonnée DRYG, riche en aspartate, arginine, tyrosine et glycine, et la région désordonnée riche en arginine (ARM) en C-terminal. Les domaines RRM et ARM sont connus pour se lier à l'ARN, tandis que la région DRYG est essentielle à l'auto-association de l'eIF4B. La surexpression d'eIF4B dans les cellules cancéreuses pourrait influencer la formation des granules de stress, et son activité est régulée par la phosphorylation, en particulier aux sites Ser406 et Ser422.Malgré l'importance de l'eIF4B, seul son domaine RRM structuré a été caractérisé au niveau atomique. Les détails moléculaires de sa région intrinsèquement désordonnée (IDR) restent inconnus, car ces protéines sont difficiles à étudier en raison de leur hétérogénéité conformationnelle et de leur comportement dynamique. Pendant ma thèse, j'ai poursuivi quatre objectifs :(i) caractériser structurellement l'IDR de l'eIF4B à l'état monomérique ;(ii) explorer la dynamique conformationnelle et les interactions de l'IDR au niveau moléculaire lors de l'oligomérisation et de la condensation à l'échelle mésoscopique ;(iii) étudier les dynamiques conformationnelles de l'IDR lors des interactions avec l'ARN ;(iv) analyser l'impact des mutations phosphomimétiques de l'eIF4B sur l'auto-association, sur la séparation de phase et sur les interactions ARN-protéine.Grâce au transfert d'énergie par résonance de Förster à molécule unique (smFRET), j'ai étudié l'IDR de l'eIF4B en tant que monomère, révélant un comportement conformationnel non uniforme et une flexibilité variable selon les régions. La région DRYG, bien que désordonnée, est étonnamment compacte, tandis que la région C-terminale (CTR) est plus étendue et flexible. Ces caractéristiques sont largement dictées par la composition spécifique de chaque sous-région. SmFRET a aussi permis d'analyser l'oligomérisation de l'eIF4B et les changements conformationnels associés. L'augmentation de la concentration protéique au-delà d'un certain seuil a conduit à une séparation de phase d'eIF4B. Ces analyses ont permis de cartographier un paysage d'auto-association complexe d'eIF4B, passant des monomères aux oligomères et aux gouttelettes condensées. Les mutations phosphomimétiques S406E et S422E n'affectent que peu l'oligomérisation d'eIF4B, mais réduisent sa tendance à la séparation des phases.Enfin, une combinaison d'expériences smFRET et RMN a permis d'étudier les interactions eIF4B-ARN. Il en ressort que la liaison concerne principalement la région 332 à 457, qui se compacte lors de la liaison à l'ARN. Cette interaction dépend de la force ionique, suggérant que les interactions électrostatiques en sont le moteur principal, tandis que la spécificité pour les ARN riches en guanosine indique des interactions π-π supplémentaires. Notamment, les mutations phosphomimétiques Ser406 et Ser422 affectent significativement l'affinité de liaison entre l'eIF4B et l'ARN. En résumé, ce travail offre une compréhension approfondie du comportement conformationnel de l'eIF4B et des mécanismes de ses interactions, fournissant des éclaircissements sur la manière dont une protéine sans structure stable peut remplir des fonctions essentielles.

The structure-function paradigm defines that protein function is determined by its structure, and detailed structural knowledge provides critical insights into its functional mechanisms. This paradigm has been challenged with the intrinsically disordered proteins (IDPs) that lack a stable structure, yet they are functional under physiological conditions. Eukaryotic translation initiation factor 4B (eIF4B) is an IDP involved in the regulation of translation initiation in eukaryotes. As an essential co-factor of RNA helicase eIF4A, eIF4B is particularly important for translation of mRNAs with long and structured 5' untranslated regions. It contains several defined functional domains/regions, including the structured N-terminal RNA recognition motif (RRM) domain, the disordered DRYG region, enriched with aspartate, arginine, tyrosine and glycine and the disordered C-terminal arginine-rich motif (ARM) region. While the RRM and ARM domains mediate RNA binding, the DRYG region is essential for eIF4B self-association. eIF4B is overexpressed in cancer cells, and may influence stress granule formation. The cellular activity of eIF4B is regulated by phosphorylation, notably at Ser406 and Ser422 residues.Despite its importance, only the well-structured RRM domain has been characterized at atomic level. The molecular details of its large intrinsically disordered region (IDR) are still unknown, as proteins of this nature are difficult to characterize due to their conformational heterogeneity and dynamic behavior. During my PhD work I had four objectives:i) structural characterization of eIF4B IDR in its monomeric state;ii) characterization of conformational dynamics and interactions of eIF4B IDR on the molecular level upon oligomerization and upon condensation on the mesoscopic scale;iii) investigation of conformational dynamics of eIF4B IDR upon RNA interactions;iv) analysis of the impact of key phosphomimetic mutations on eIF4B protein - protein interactions, eIF4B condensation and eIF4B - RNA interactions.Using single-molecule Förster resonance energy Transfer spectroscopy (smFRET) I studied the eIF4B IDR as a monomer, demonstrating its non-uniform conformational behavior and flexibility, with different regions showing varying degrees of compactness and dynamics. Although the DRYG region is disordered, it is surprisingly compact, whereas the CTR is more expanded and flexible. These characteristics are largely dictated by the specific sequence composition of each subregion. smFRET also enabled probing eIF4B oligomerization behavior and associated protein conformational changes. Increasing the protein concentration above certain thresholds lead to eIF4B phase separation, which was studied by dedicated phase separation assays. Altogether, these experiments enabled mapping of the self-association landscape of eIF4B, which represents a complex transition from monomers to oligomers to condensed droplets. Interestingly, phosphomimetic mutations, such as S406E and S422E minimally affect eIF4B oligomerization, but considerably reduce the phase separation propensity.Finally, I used a combination of smFRET and NMR experiments to investigate eIF4B - RNA interactions, confirming that binding primarily involves the 332 to 457 region (overlapping with previously identified ARM region), which undergoes compaction upon RNA binding. The binding is ionic strength dependent, suggesting that electrostatic interactions are the main driving force, while sequence specificity towards guanosine-containing RNAs, indicates additional π-π stacking interactions. Importantly, the Ser406 and Ser422 phosphomimetic mutations within the RNA binding region significantly affect eIF4B-RNA binding affinity.Altogether, this work provides a detailed molecular understanding of conformational behavior of eIF4B and mechanisms of its interactions.