Analysis of the proteasome-autophagy crosstalk under proteotoxic stress conditions in acute myeloid leukemia

par Rosa Guadalupe Lopez Reyes

Thèse de doctorat en Cancérologie

Sous la direction de Manuel Rodriguez et de Pierre Lutz.

  • Titre traduit

    Analyse de la diaphonie protéasome-autophagie dans des conditions de stress protéotoxique dans la leucémie myéloïde aiguë


  • Résumé

    La leucémie myéloïde aiguë (LAM) représente un groupe hétérogène d'hématopathies malignes caractérisées par une prolifération clonale de progéniteurs hématopoïétiques bloqués dans leur différenciation (blastes), qui s'accumulent dans la moelle osseuse, le sang et d'autres organes. Le LAM fait chaque année plus de 3000 morts en France. Différentes mutations génétiques se trouvent dans le LAM, parmi lesquelles celles affectant l'activité des récepteurs de kinase : KIT et FLT3-ITD. La duplication interne en tandem dans le récepteur FLT3 (FLT3-ITD), représente 30% des cas de LAM, et a un mauvais pronostic, par rapport aux patients exprimant le récepteur de type sauvage. Les patientes atteintes de leucémie aiguë myéloïde présentant une duplication interne en tandem dans le récepteur FLT3 (FLT3-ITD), les patients atteints de FLT3-ITD représentent 30% des cas de leucémie aiguë myéloïde (LAM), et ont un mauvais pronostic de survie par rapport aux patients exprimant le récepteur de sauvage. Des études antérieures ont démontré que l'autophagie régule la cytotoxicité induite par l'inhibition du protéasome dans les cellules de LAM FLT3-ITD. Dans cette étude, les conditions de stress protéotoxique générées par le bortézomib (Bz) ont entraîné la dégradation des sous-unités du protéasome dans les cellules FLT3-ITD MOLM-14 mais pas dans les cellules FLT3-WT OCI-AML3, ce qui suggère que la mutation ITD contribue à activer la protéolyse par autophagie du protéasome, connue sous le nom de proteaphagie. L'inhibition chimique de l'autophagie avec la bafilomycine A (BafA) a bloqué la protaphagie et favorisé l'accumulation des sous-unités centrales du protéasome accumulées dans les autophagosomes des cellules MOLM-14 traitées au Bz. Pour étudier le rôle de l'ubiquitylation des protéines dans la protaphagie, nous avons utilisé des TUBE distincts (Tandem Ubiquitin Binding Entities). Alors que TUBE-HHR23 capture p62, les sous-unités de protéasome et les formes ubiquitylées de FLT3, TUBE-p62 ne le fait pas. Néanmoins, TUBE-p62 a protégé la forme non modifiée de FLT3-ITD de la dégradation provoquée par Bz. Selon nos résultats, l'inhibiteur de la p62 Verteporfin (VT) a bloqué la protaphagie et a réduit la colocalisation de la sous-unité centrale p62 avec alpha2 mais n'a pas affecté celle de p62 avec Rpn1. VT a également protégé FLT3-ITD de la dégradation induite par Bz et augmenté la colocalisation de p62 dans les cellules MOLM-14. Les deux inhibiteurs de l'autophagie ont augmenté l'apoptose induite par le Bz dans les cellules MOLM-14, suggérant que ces traitements combinatoires pourraient être une stratégie thérapeutique pour cibler les cellules positives FLT3-ITD. Ainsi, la protéolyse médiée par le protéasome et l'autophagie est très probablement dans un équilibre dynamique et joue un rôle important lorsque l'une ou l'autre voie est altérée.


  • Résumé

    Acute myeloid leukemia (AML) represents a heterogeneous group of malignant hematopathies characterized by a clonal proliferation of hematopoietic progenitors blocked in their differentiation (blasts), which accumulate in the bone marrow, blood, and other organs. The AML causes more than 3000 death every year in France. Different genetic mutations are found in the AML, among them the ones affecting the kinase receptor activity: KIT and FLT3-ITD. The internal tandem duplication in the FLT3 receptor (FLT3-ITD), represents 30% of cases of AML, and has a poor prognosis, compared to patients expressing the wild-type receptor. Previous studies have demonstrated that autophagy regulates cytotoxicity in FLT3-ITD AML cells after proteasome inhibition. In this study proteotoxic stress conditions generated by Bortezomib (Bz) resulted in the degradation of proteasome subunits in FLT3-ITD MOLM-14 cells but not in FLT3-WT OCI-AML3 cells, suggesting ITD mutation contributes to activate autophagy-mediated proteolysis of the proteasome, known as proteaphagy. In this study, using chemical inhibition of autophagy with Bafilomycin A (BafA) we blocked proteaphagy and accumulated proteasome core subunits into autophagosomes of Bz-treated MOLM-14 cells. To investigate the role of protein ubiquitylation in proteaphagy, we used distinct TUBEs (Tandem Ubiquitin Binding Entities). While TUBE-HHR23 captures p62, proteasome subunits and ubiquitylated forms of FLT3, TUBE-p62 does not. Nevertheless, TUBE-p62 protected the unmodified form of FLT3-ITD from degradation driven by Bz. According to our results, the p62 inhibitor Verteporfin (VT) blocked proteaphagy and reduced the colocalization of p62/alpha2 core subunit but did not affected the one of p62/Rpn1. VT also protected FLT3-ITD from Bz-induced degradation and colocalized within p62 in MOLM-14 cells. Both autophagy inhibitors enhanced Bz-induced apoptosis in MOLM-14 cells suggesting that these combinatorial treatments could be a therapeutic strategy to sensitize FLT3-ITD positive cells. This study allowed us to understand that the proteasome- and autophagy-mediated proteolysis are most likely in a dynamic equilibrium and play an important role when one or the other pathway is impaired.


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Cette thèse a donné lieu à une publication en 2020 par Université Paul Sabatier à Toulouse

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Informations

  • Sous le titre : Analysis of the proteasome-autophagy crosstalk under proteotoxic stress conditions in acute myeloid leukemia
  • Détails : 1 vol. (190 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 134-189
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