Développement d'une nouvelle approche par spectrométrie de masse ciblée pour la caractérisation de la virulence et des résistances aux antibiotiques chez les bactéries

par Nicolas Mouton

Thèse de doctorat en Chimie analytique

Sous la direction de Fabien Chirot et de Sophie Ayciriex.

Soutenue le 16-12-2020

à Lyon , dans le cadre de École Doctorale de Chimie (Lyon) , en partenariat avec Université Claude Bernard (Lyon) (établissement opérateur d'inscription) et de Institut des Sciences Analytiques (laboratoire) .

Le président du jury était Marie-Cécile Ploy.

Le jury était composé de Fabien Chirot, Sophie Ayciriex, Virginie Brun, Jean Armengaud, François Vandenesch.

Les rapporteurs étaient Virginie Brun, Jean Armengaud.


  • Résumé

    L’incidence des résistances multiples aux antibiotiques est un problème de santé publique mondial qui peut conduire à une impasse thérapeutique lors du traitement des infections bactériennes. L’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) a établi une liste de pathogènes prioritaires (ESKAPE) du fait de l’apparition de souches multi-résistantes. Cette liste a été dressée dans le but d’orienter et de promouvoir la recherche et le développement de nouveaux antibiotiques pour lutter contre la résistance aux antibiotiques. L’identification de la bactérie et la caractérisation de son profil de résistance sont des informations essentielles pour la mise en place la plus rapide possible d’une antibiothérapie ciblée. L’objectif global de ce travail de thèse mené au sein de l’équipe ANABIO-MS de l’Institut des Sciences Analytiques était d’évaluer les potentialités de l’analyse protéomique ciblée ascendante (« bottom-up ») pour identifier un pathogène et/ou caractériser ses mécanismes de virulence et de résistance aux antibiotiques. La première partie des travaux de la thèse, réalisée dans le cadre d’une collaboration avec le Centre International de Recherche en Infectiologie (CIRI), a été dédiée au développement d’une méthode de dosage relatif des facteurs de virulence de Staphylococcus aureus à l’aide du mode d’acquisition ciblé, MRM (Multiple Reaction Monitoring). L’optimisation du temps requis pour la préparation d’échantillon a été un des objectifs principaux de ce développement. Notamment grâce à l’utilisation d’un système à ultrasons modifié afin d’effectuer simultanément la lyse des bactéries et l’hydrolyse enzymatique par la trypsine des protéines, à une température thermo régulée. La température, le temps de lyse/digestion ainsi que l’influence de microbilles de verre ont été évalués pour aboutir à un protocole optimisé de 10 min de lyse/digestion à 50°C. Un grand nombre de paramètres influençant la quantification et le retraitement des données ont également été évalués dans le but d’assurer une robustesse maximale à la méthode. La méthode a ensuite été déployée pour quantifier 50 facteurs de virulence au sein d’une cohorte de 300 souches cliniques de S. aureus (Cohorte VIRSTA et PHRC, investigateur Pr. F. Vandenesch) afin d’identifier des marqueurs prédictifs de la sévérité de l’infection. La seconde partie des travaux de thèse s’est focalisée sur l’exploitation d’un tout nouveau mode d’acquisition ciblée appelé Scout-MRM, pour concevoir un arbre de décision en temps réel du suivi des transitions spécifiques des peptides rapporteurs nécessaires à l’identification (ID) du pathogène ainsi qu’à la caractérisation de son profil de résistance aux antibiotiques. Afin de réaliser cette première preuve de concept, une méthode Scout-MRM a été développée utilisant dans un premier groupe de transition les peptides ribosomaux spécifiques du genre ou de l’espèce (groupe ESKAPE) des bactéries comme nœuds d’orientation déclenchant de nouveaux groupes de transitions intégrant des peptides rapporteurs de mécanismes de résistances (MecA ; VIM ; NDM ; Oxa-48 ; TEM ; KPC ; CTX-M ; OXA-10 ; AmpC) et d’autres permettant la confirmation du genre et de l’espèce. Par ailleurs, une attention particulière a été portée à l’optimisation d’un protocole de préparation de l’échantillon et d’analyse qui soit tout à la fois rapide et robuste pour procéder en moins d’une heure à un diagnostic exhaustif, et ce directement à partir d’un aliquot d’hémoculture positive. Les résultats obtenus montrent un score de spécificité de 100 % pour l’identification de l’espèce et du genre ainsi que de 95 % pour les différents mécanismes de résistances aux antibiotiques. Les résultats prometteurs issus de ces travaux de thèse combinés à ceux obtenus par d’autres membres de l’équipe se poursuivent dans la perspective de pouvoir disposer, d’ici mi-2021, d’une méthode Scout-MRM ciblant les espèces les plus fréquentes dans les infections du sang

  • Titre traduit

    Development of a new targeted mass spectrometry approach for the characterisation of virulence and antibiotic resistance in bacteria


  • Résumé

    The incidence of multiple antibiotic resistance is a global public health threat that can lead to a therapeutic impasse in the treatment of bacterial infections. The World Health Organization (WHO) has established a list of priority pathogens (ESKAPE) due to the emergence of multi-resistant strains. This list was designed to guide and promote the research and development of new antibiotics to counter antibiotic resistance. The identification of the bacterium and the characterization of its resistance profile are essentials informations in order to set up as quickly as possible a targeted antibiotic therapy. The overall objective of this thesis work, carried out within the ANABIO-MS team of the Institute of Analytical Sciences, was to evaluate the potential of bottom-up targeted proteomic analysis to identify a pathogen and/or characterize its virulence and antibiotic resistance mechanisms. The first part of the thesis work, conducted in the framework of a collaboration with the Centre International de Recherche en Infectiologie (CIRI), was dedicated to the development of a method for the relative quantification of Staphylococcus aureus virulence factors using the targeted acquisition mode, MRM (Multiple Reaction Monitoring). The optimization of the time required for sample preparation was one of the main objectives of this development. In particular, by using a modified ultrasound system to simultaneously perform bacterial lysis and enzymatic trypsin hydrolysis of proteins at a thermo-regulated temperature. The temperature, the lysis/digestion time and the influence of glass microbeads were evaluated in order to obtain an optimized protocol of 10 min lysis/digestion at 50°C. A large number of parameters influencing the quantification and reprocessing of the data were also evaluated in order to ensure maximum robustness of the method. The method was then deployed to quantify 50 virulence factors in a cohort of 300 clinical strains of S. aureus (VIRSTA and PHRC cohort, investigator Pr. F. Vandenesch) in order to identify predictive markers of infection severity. The second part of the PhD work was focused on the exploitation of a brand new targeted acquisition mode called Scout-MRM, to design a real-time decision tree for the monitoring of specific transitions of reporter peptides necessary for the identification (ID) of the pathogen as well as for the characterization of its antibiotic resistance profile. In order to achieve this first proof of concept, a Scout-MRM method has been developed using in a first transition group the genus or species specific ribosomal peptides (ESKAPE group) of bacteria as orientation nodes triggering new transition groups integrating reporter peptides of resistance mechanisms (MecA; VIM; NDM; Oxa-48; TEM; KPC; CTX-M; OXA-10; AmpC) and others allowing the confirmation of the genus and species. In addition, particular attention was paid to the optimization of a rapid and robust sample preparation and analysis protocol to provide a complete diagnosis in less than one hour, directly from a positive blood culture aliquot. The results obtained show a specificity score of 100% for species and genus identification and 95% for the different antibiotic resistance mechanisms. The promising results from this thesis work combined with those obtained by other members of the team are being pursued with a view to having, by mid-2021, a Scout-MRM method targeting the most frequent species in blood infections as well as the most critical associated antibiotic resistance mechanisms. The interest of the proposed method for diagnosis (specificity, sensitivity, classification of the level of resistance) will be evaluated against standardised methods by analysing routine hospital samples



Le texte intégral de cette thèse sera accessible librement à partir du 16-09-2022

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