La phosphatase PPM9 de Plasmodium : caractérisation moléculaire et fonctionnelle, structure 3D du site catalytique et découverte de nouvelles molécules antipaludiques

Plasmodium protein phosphatase PPM9 : molecular and functional characterization, 3D structure of catalytic active site and antimalarial drug discovery

• Auteur / Autrice : Cécilia N'Guessan
• Direction : El Moukhtar Aliouat
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance le 17/06/2020
• Etablissement(s) : Université de Lille (2018-2021)
• Ecole(s) doctorale(s) : École graduée Biologie-Santé (Lille ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre d'Infection et d’Immunité de Lille - Centre d’Infection et d’Immunité de Lille - INSERM U 1019 - UMR 9017 - UMR 8204
• Jury : Président / Présidente : Benoît Foligné
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : El Moukhtar Aliouat, Benoît Foligné, Isabelle Florent, Cédric Logé, Mauld Lamarque, Isabelle Landrieu, Jamal Khalife
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Isabelle Florent, Cédric Logé

Mots clés

Mots clés contrôlés

Découverte de médicament

Dépistage génétique

Génie génétique

Paludisme

Innovations pharmaceutiques

Criblage pharmacologique

Phosphatases

Génie génétique

Paludisme

Mots clés libres

Paludisme

Plasmodium

Phosphatases

Génétique inverse

Cible thérapeutique

Découverte de nouveaux médicaments

Criblage de molécules

Malaria

Plasmodium

Phosphatases

Reverse genetic

Therapeutic target

Drug design

Drug screening

Résumé

Le paludisme est l’une des maladies infectieuses les plus répandues à travers le monde. En 2018, cette parasitose fut responsable de 405 000 morts. RTS, S/A01, le seul vaccin testé à grande échelle, ne remplit pas à ce jour tous les critères d’efficacité exigés. Plasmodium falciparum (Pf), l’espèce responsable de la plus forte mortalité, a développé des résistances contre quasi tout l’arsenal thérapeutique. Il est crucial d’approfondir nos connaissances sur la biologie de ce parasite, en vue de découvrir de nouveaux médicaments. Chez Pf, de nombreuses études ont montré que les kinases et les phosphatases jouent un rôle crucial pour la survie du parasite. L’étude du kinome a permis de mettre en lumière que cibler les kinases pouvait représenter une stratégie intéressante dans le traitement de la maladie. Toutefois, les phosphatases de Pf restent peu étudiées. Des analyses comparatives des séquences en acides aminés, réalisées chez P. berghei (Pb), espèce spécifique des rongeurs, ont révélé que 6 d’entre elles sont spécifiques du genre Plasmodium. Parmi ces phosphatases, la métallophosphatase 9 (PPM9) une sérine thréonine phosphatase spécifique de Plasmodium, semble être essentielle dans le développement des stades érythrocytaires du parasite. Le gène a également été identifié comme étant essentiel chez Pf, grâce à une méthode de mutagénèse saturante à haut débit. Notre projet a pour objectif la caractérisation moléculaire et fonctionnelle de PPM9 et la validation de cette phosphatase spécifique de Plasmodium, en tant que nouvelle cible potentielle pour le paludisme. Le gène a été cloné, annoté, exprimé sous forme de protéine recombinante et sa fonction phosphatase caractérisée. L’activité enzymatique de PfPPM9 recombinante a été standardisée au sein du test au Malachite Green et nous avons montré qu’elle était dépendante de l’ion manganèse. La caractérisation fonctionnelle, a été explorée via la construction de lignées knock-out conditionnelles mais également des lignées parasitaires knock-in pour suivre leur trafic tout au long du cycle de vie (chez Pf et Pb). Nous avons en effet montré une localisation principalement cytoplasmique de PPM9 et suggéré un export possible dans le cytoplasme de l’hématie. Par ailleurs, parmi ces études de génétique inverse, nous avons notamment employé la technologie CRISPR-Cas9 facilitant l’utilisation de la Cre recombinase dimérisable (diCre) qui permet d’exciser une séquence d’ADN flanquée par des sites loxP, après activation de la rapamycine. Enfin, nous avons déterminé une structure 3D putative de PfPPM9 par homologie comparative afin d’identifier in silico des inhibiteurs spécifiques de son site actif. Un criblage virtuel a ainsi été réalisé avec la database ZINC15 et celle de L’ICPAL sur notre structure 3D. Environ 80 composés ont été testés pour leur activité antipaludique in vitro. Trois hits ont été mis en évidence : M19, M51 et M74. M19 possède une concentration inhibant 50% de la croissance parasitaire (CI50) de 3,87 μM +/- 0,25 et une structure originale jamais encore décrite comme composé antipaludique. De plus, via des études en RMN (Waterlogsy et CPMG), nous avons montré une interaction spécifique de ces hits avec PfPPM9. En perspective, l’intéractome de PPM9 devrait permettre de déterminer ses partenaires/cibles protéiques chez le parasite. En conclusion, ce projet nous conduira à une meilleure compréhension du rôle de PPM9 dans le développement du parasite et la découverte de nouvelles molécules antipaludiques.

Malaria today is one of the wide spread infectious diseases in the world. In 2018, 405 000 malaria deaths have been reported. RTS, S/A01 the only vaccine tested on a large scale does not fulfil its promises with a lack of efficiency. Plasmodium falciparum (Pf), the deadliest agent of malaria, has developed resistances to almost all chemotherapeutics. It is necessary to understand the biology of this parasite in order to develop new drugs. In Pf, extensive research has now been started to study the Pf kinome and to examine whether targeting kinases could represent an effective mean for the treatment of the infection, the study of its phosphatome is still under-investigated. Amino acid sequence comparative analyses of Plasmodium berghei (Pb), a rodent malaria species, revealed that 6 are Plasmodium specific. Among these phosphatases, the metalloprotein phosphatase 9 (PPM9), a Plasmodium specific serine/threonine phosphatase, was also suggested to be essential for blood stage parasites development. Besides in a high-throughput saturation mutagenesis method in Pf, PPM9 gene was also identified essential. The present project is focused on the molecular and functional characterization of the PPM9 and on the validation of this specific phosphatase as a new potential target for malaria. The gene has been cloned, annotated and expressed as a recombinant protein and its phosphatase function has been characterized. The enzymatic activity of PfPPM9 recombinant protein has been standardised using a malachite green phosphate assay kit and this activity is manganese dependant. Functional characterization was explored by conditional gene knock-out studies as well as by generating knock-in parasite lines to follow their trafficking during the parasite lifecycle (in Pf and Pb). PfPPM9 seems to be mainly localised in the parasite cytoplasm and could be exported in the cytoplasm of red blood cell. Among these studies, we employ CRISPR-Cas9 in Pf to facilitate use of the dimerisable Cre-recombinase (diCre) that is used to mediate the excision and loss of loxP-flanked DNA sequences in a rapamycin-controlled manner. Finally, we solved in silico the 3D structure of PfPPM9 by homology modelling and identified a new set of potential specific inhibitors. We screened in silico ZINC15 database and ICPAL base on the 3D structure. We have tested around 80 compounds for their anti-plasmodial in vitro activity. We have highlighted 3 hits: M19, M51 and M74. M19 has a half maximal inhibitory concentration (IC50) of 3,87 μM +/- 0,25 and a unique scaffold as antimalarial compound. Besides, via NMR studies (Waterlogsy and CPMG), we have shown a specific interaction between these hits and PfPPM9. As a perspective, PPM9 interactome will be carried out to determine its target/partner proteins in the parasite. In conclusion, this study will lead to a deeper understanding of the role of PPM9 in the parasite development and the discovery of new antimalarial compounds.