Caractérisation structurale et fonctionnelle du réseau de 3 histidine kinases qui régissent la formation de biofilm chez Pseudomonas aeruginosa

Structural and functional analysis on GacS homodimeric histidine kinase reveals a non-canonical autokinase activity and new insights into the heterodimer partnership with RetS

• Auteur / Autrice : Violla Abdallah Bassim
• Direction : Florence Vincent
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie structurale
• Date : Soutenance le 24/09/2020
• Etablissement(s) : Aix-Marseille
• Ecole(s) doctorale(s) : École Doctorale Sciences de la vie et de la santé (Marseille)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques (AFMB) (Marseille ; 2012-....)
• Jury : Président / Présidente : Romé Voulhoux
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Christophe Greangeasse
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Alberto Marina, Isabelle Schalk

Mots clés

Mots clés contrôlés

Radiocristallographie

Anticorps

Protéines recombinées

Phosphorylation

Histidine kinases

Mucoviscidose

Biofilms

Pseudomonas aeruginosa

Mots clés libres

Pseudomonas aeruginosa

Biofilm

Mucoviscidose

Systems à deux composants

Histidine kinases

Phosphorylation

Infection

Purification

Protéines recombinantes

Cristallographie aux rayons X

Études d’interaction

Relation structure-Fonction

Anticorps

Pseudomonas aeruginosa

Biofilm

Cystic fibrosis

Two-Component systems

Histidine kinases

Phosphorylation

Acute-To-Chronic infection transition

Protein purification

X-Ray crystallography

Interaction studies

Structure-Function relationship

Nanobodies

Résumé

Pseudomonas aeruginosa (PA) est un pathogène qui infecte particulièrement les patients atteints de la mucoviscidose. PA provoque des infections aiguës et chroniques et alterne entre des modes de vie planctonique et sédentaire. Cette transition est principalement régulée par les systèmes à deux composants (TCS). Durant ma thèse, je me suis focalisée sur le TCS GacS/GacA, impliqué dans un réseau de signalisation multikinase. GacS est une histidine kinase (HK) et GacA est son régulateur de réponse (RR). La région cytoplasmique de GacS est composée des domaines HAMP, S-Hélice, H1, D1 et H2. Des tests fonctionnels ont montré que la région HAMP/S-Hélice est nécessaire pour la transduction du signal et contribue à son activité. L’analyse structurale a montré une boucle de fixation de l’ATP structurée contrairement à ce qui est observé dans d'autres HKs. De plus, un nouveau domaine (ND) a été identifié et s’est révélé essentiel pour assurer une activité autokinase. Nous avons proposé que le ND contribue à des changements conformationnels pour placer GacS dans une configuration active. Par ailleurs, RetS HK inhibe GacS par des interactions directes. Des tests de spectrométrie de masse native et des tests d’interaction ont montré que le domaine HAMP est nécessaire pour assurer l'interaction entre ces HKs. De plus, des anticorps à domaine unique contre GacS nous ont permis d’identifier des sites potentiels d'inhibition de la voie GacS/GacA et de la formation de biofilm. Dans cette étude, nous avons dévoilé une activité autokinase non canonique de GacS et de nouvelles perspectives sur son interaction avec RetS qui contribuent au processus décisionnel pendant l'infection par PA.

Pseudomonas aeruginosa (PA) is a pathogen that particularly infects patients with cystic fibrosis. PA causes acute and chronic infections and can switch from a planktonic to a sedentary lifestyle. This transition is mainly coordinated by Two-Component Systems (TCS). During my thesis, I focused on GacS/GacA TCS, a master regulator of the acute-to-chronic transition. In fact, GacS is a membrane-bound histidine kinase (HK) and GacA is the response regulator (RR). GacS cytoplasmic region is composed by the HAMP, S-Helix coiled-coil region. This helical part is followed by the H1, the D1 and H2 domains. GacS/GacA TCS is involved in a multikinase regulatory network and its activity is modulated by three HKs. Mutagenesis and functional assays showed that the HAMP and S-Helix orchestrate the signal transduction prior to its autokinase activity. In addition, GacS presented a folded ATP lid in contrast to what is observed in other HKs. Furthermore, we unveiled a new domain (ND) in GacS sequence. Functional assays showed that the ND domain is essential to insure a full autokinase activity of GacS. We proposed that this domain contributes in conformational rearrangements in order to shift GacS to its active state. RetS HK is known to inhibit GacS/GacA via direct interactions. Native mass spectrometry and microscale thermophoresis assays showed that the HAMP domain is essential for this interaction. Furthermore, nanobodies generated against the cytoplasmic region of GacS revealed potential sites of inhibition of GacS activity. In this study, we unveiled a non-canonical autokinase activity in GacS and new insights into its interaction with RetS that underlie the decision-making of PA.