An in vitro model for the mouse Epiblast to investigate the establishment of the antero-posterior polarity.

par Sara Bonavia

Thèse de doctorat en Physique

Sous la direction de Jean-Marc Di Meglio et de Benoît Sorre.

Le président du jury était Sylvie Hénon.

Le jury était composé de Jean-Marc Di Meglio, Benoît Sorre, Sylvie Hénon, Iftach Nachman.

Les rapporteurs étaient Nicolas Rivron, Iftach Nachman.

  • Titre traduit

    Un modèle in vitro de l’Épiblaste de la souris pour l’étude de l’établissement de la polarité antero-posterieure


  • Résumé

    Le développement d'un embryon est une interaction de phénomènes, impliquant des réarrangements morphogénétiques, mouvement collective et différenciation cellulaire. Comment une forme complexe, composée de nombreux tissus différents, résulte d'un pool symétrique de cellules identiques n'est pas encore totalement dévoilé. Dans cette thèse, nous nous intéressons à comprendre l'un des premiers événements qui brise la symétrie de l'embryon et établit une direction dans laquelle les différents tissus du futur corps seront répartis : l'établissement de la polarité antéro-postérieure (A-P), qui marquera le locus où la gastrulation va commencer. La manière dont cet axe est établi a été partiellement élucidée. Nous savons que le processus est contrôlé par des signaux chimiques, morphogènes, sécrétés par certains sous-groupes de cellules du tissu extra-embryonnaire. Les conditions minimales d'observation de la polarité ne sont cependant pas encore claires. Avec ce travail, nous avons l'intention de construire un système synthétique in vitro pour découvrir les ingrédients minimaux pour observer la brisure de symétrie dans une structure symétrique, qui imite l'épiblaste en morphologie et en expression génétique. Nous observons comment ce système réagit sous stimulation homogène avec des morphogènes. Nous comparons les résultats obtenus, à une situation où la symétrie du stimulus est brisée. Pour stimuler les cellules avec un stimulus directionnel, nous faisons recours à la microfluidique : nous avons développé un dispositif qui nous permet de stimuler notre épiblaste synthétique avec un gradient de morphogènes. Notre dispositif d'origine reposait sur un débit continu pour établir un puits et une source parfaits pour maintenir le gradient. Nous avons observé une perte d’expression du gene Nodal que nous n'avons pas observée en stimulant les organoïdes uniformément. Nous émettons l'hypothèse que le débit continu est responsable de l'élimination d'une partie de la signalisation sécrétée par les cellules. En modifiant le dispositif pour induire une stimulation uniforme, mais en produisant un gradient de molécules sécrétées, nous avons pu observer la polarité des organoïdes d'une manière plus cohérente qu'en les stimulant uniformément. Nous concluons que ces expériences suggèrent l'existence d'un mécanisme d'autorégulation dans l'embryon pour établir la polarité, et que ce mécanisme coopère avec d'autres pour assurer la robustesse de la polarisation, et qu'une source localisée de molécules de signalisation pourrait être pertinente pour augmenter la fréquence de l'observation de la polarité des organoides des cellules souches embryonnaires. Nous prévoyons que d'autres études utilisant des gradients statiques permettront de pousser ce résultat plus loin. Enfin, nous proposons un système qui permettrait d'étudier un aspect sous-investi du développement : le rôle du confinement physique. Comme on le voit, l'embryon précoce est confiné par le tissu extra-embryonnaire, lui appliquant une contrainte. Nous suggérons qu'il serait intéressant d'étudier l'aspect confinement, en le dissociant de l'aspect signalisation. Pour ce faire, nous proposons d'adapter une méthode d'encapsulation développée à l'origine pour cultiver des organoïdes de cellules cancéreuses, pour encapsuler des cellules souches embryonnaires.


  • Résumé

    The development of an embryo is an interplay of phenomena, involving morphogenetic rearrangements, collective migration and cell differentiation. How a complex shape, made of many different tissues, arises from a symmetric pool of identical cells is still not fully unveiled. In this thesis, we are interested in understanding one of the first events that breaks the symmetry of the embryo and establishes a direction along which, the different tissues of the future body will be allocated: the establishment of the Antero-Posterior polarity (A-P), that will mark the locus at will gastrulation will start. How this axis is established has been partly elucidated. We know that the process is controlled by some chemical signalling, morphogens, released by some subgroups of cells in the extra-embryonic tissue. The minimal conditions for observing polarity however are still not clear. With this work we intend to build a synthetic in vitro system to find out the minimal ingredients to observe symmetry breaking in a symmetrical structure, that mimics the Epiblast in morphology and gene expression. We observe how this system reacts under homogeneous stimulation with morphogens. We compare the results obtained, to a situation where the symmetry of the stimulus is broken. To feed the cells with a directional stimulus, we make use of microfluidics: we developed a device that allows us to stimulate our synthetic Epiblast with a gradient of morphogens. Our original device was relying on continuous flow to establish a perfect sink and source to maintain the gradient. We observed a loss of Nodal expression that we did not observe when stimulating the organoids in bulk. We hypothesise the continuous flow to be accountable for washing out some secreted signalling downstream of the signal we induce differentiation with. By modifying the device to induce a uniform stimulation, but producing a gradient of secreted molecules, we were able to observe polarity arising in the organoids in a more consistent way than in bulk. We conclude that these experiments hint to the existence of a self-regulated mechanism in the embryo to establish polarity, and that this mechanism co-operate with others to ensure the robustness of the polarisation, and that a localised source of signalling molecules could be relevant to increase the frequency of observation of polarity in Embryonic Stem Cells only organoids. We anticipate that further studies making use of static gradients devices would allow to push this result further. Last, we propose a system that would allow the study of an underinvestigated aspect of development: the role pf physical confinement. As seen, the early embryo is confined by the Extra-embryonic tissue, applying a constraint to it. We suggest that it would be interesting to study the confinement aspect, uncoupling it from the signalling aspect. To do so, we propose to adapt an encapsulation method originally developed to grow cancer cells organoids, to encapsulate Embryonic Stem Cells.


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