Overlaps in the regulatory networks of Listeria monocytogenes in response to environmental cues

par Catarina Moreira Marinho

Thèse de doctorat en Biologie des organismes

Sous la direction de Pascal Piveteau et de Conor O'Byrne.

Soutenue le 27-08-2019

à Bourgogne Franche-Comté en cotutelle avec l'University college (Galway, Irlande) , dans le cadre de École doctorale Environnements, Santé (Dijon ; Besançon ; 2012-....) , en partenariat avec Agroécologie (Dijon) (laboratoire) , Agroécologie [Dijon] (laboratoire) et de Université de Bourgogne .

Le président du jury était Romain Briandet.

Le jury était composé de Kate Reddington.

Les rapporteurs étaient Alice Lebreton, Olivier Dussurget.

  • Titre traduit

    Étude des interconnexions dans les réseaux de régulation de Listeria monocytogenes en réponse aux conditions de l'environnement


  • Résumé

    Listeria monocytogenes est une bactérie ubiquiste présente dans des habitats variés. Chez des personnes au système immunitaire affaibli, l’ingestion d’aliments contaminés par L. monocytogenes peut provoquer la listériose, une maladie qui se caractérise par un taux de mortalité très élevé. Sa capacité d'adaptation aux conditions environnementales repose sur un réseau complexe de régulations transcriptionnelle et post-transcriptionnelle. Le système de communication Agr participe à la régulation de plus de 700 gènes pendant la vie saprophyte et in vivo pendant le processus infectieux. Le facteur sigma alternatif Sigma B (σB) contrôle la réponse générale au stress et régule la transcription de près de 300 gènes. Certains gènes sont sous le contrôle direct ou indirect de ces deux régulateurs ce qui suggère une interconnexion entre le système Agr et σB. Par ailleurs, le rôle biologique de la plupart des petits ARN non-codants (ncARNs) reste peu caractérisé. L’objectif de ce travail de thèse était de décrypter les interconnexions entre les régulateurs AgrA et σB et d’étudier le rôle d’un ARN non codant qui pourrait participer à cette interconnexion.Dans un sol stérilisé, les populations de L. monocytogenes augmentent et la délétion du gène agrA ou du gène sigB n’affecte pas leur croissance. Dans un sol non traité, la viabilité de la souche parentale diminue progressivement. Dans ces conditions, l'inactivation de l’un ou l’autre de ces systèmes a également affecté la survie. L'analyse transcriptionnelle a confirmé l’importance d’Agr et de σB pour la survie dans le sol. La capacité à coloniser la rhizosphère était également considérablement affectée par la délétion du gène sigB. Ces données illustrent le rôle que ces systèmes de régulation jouent dans l'écologie naturelle de ce pathogène.Pendant la formation des biofilms, l'expression d’agrA, initialement faible, était maximale à la fin de la phase de croissance. L’inactivation du système Agr provoque une diminution de l'attachement cellulaire aux premières étapes de la croissance sessile. De plus, la délétion de sigB annule l’expression du système Agr alors que la délétion d’agrA entraîne un retard de l’activation du promoteur de sigB dans les cellules organisées en biofilm et soumises à un stress osmotique. Ces résultats confirment l’interconnexion des deux systèmes et suggèrent un rôle de σB dans la formation des biofilms en fonction des conditions environnementales rencontrées. La structuration du biofilm variait d’un empilement uniforme de cellules dans un milieu riche, à des structures filamenteuses et dispersées en conditions de stress osmotique. Ces résultats confirment la contribution des systèmes Agr et σB au cours de la croissance sessile de L. monocytogenes.Le rôle de l'ARN non codant Rli47 a été étudié par des approches in silico et in vivo. Plusieurs cibles ont été identifiées dont ilvA qui code la thréonine désaminase, une enzyme de la voie de biosynthèse des acides aminés à chaîne ramifiée. L’interaction entre Rli47 et la région Shine-Dalgarno de l’ARNm ilvA a été confirmée expérimentalement. La délétion de rli47 provoque une augmentation des taux de transcrits ilvA ainsi que de l'activité de l’enzyme. Par ailleurs, dans un milieu appauvri en isoleucine, le temps de latence du mutant ∆rli47 est réduit par rapport à celui de la souche parentale. Ce phénotype a également été observé dans un mutant dépourvu de σB. L'analyse du transcriptome confirme le rôle important de Rli47 dans la modulation du métabolisme des acides aminés. Les données amènent à un modèle théorique dans lequel Rli47 est un répresseur de la voie de biosynthèse de l'isoleucine ce qui pourrait limiter la croissance de L. monocytogenes lorsque les conditions environnementales sont défavorables.L’élucidation de ces réseaux de régulation permettra de mieux comprendre l’écologie de L. monocytogenes et pourrait permettre le développement d’alternatives innovantes visant à limiter son développement.


  • Résumé

    The facultative intracellular pathogen Listeria monocytogenes is a highly adaptable organism widely distributed in the environment. The ingestion of food contaminated with L. monocytogenes by at-risk individuals can ultimately lead to listeriosis, one of the leading causes of food-borne fatalities in developed countries. Regulatory networks are crucial for the adaptation and survival of this pathogen. The accessory gene regulator (Agr) system has been shown to be involved in virulence, biofilm formation, and survival of L. monocytogenes, affecting the transcription of over 700 genes. The alternative sigma factor Sigma B (σB) controls the general stress response in L. monocytogenes, regulating the transcription of almost 300 genes in response to stress. Earlier studies have suggested a regulatory overlap between the AgrA and σB regulons in L. monocytogenes. While the function of some regulatory systems is well understood, the biological role of most small regulatory RNAs (sRNAs) remains poorly characterized. This thesis aimed to decipher the interconnections between the AgrA and σB regulons in the regulatory network of L. monocytogenes, including the possible involvement of sRNAs.Growth was observed in sterile soil and similar population dynamics were shown in the wild-type (WT) strain, ∆agrA and ∆sigB mutants. In biotic soil microcosms, viability of the WT strain declined steadily, underlining the challenging nature of live soil environments. The inactivation of the two systems simultaneously (∆agrA∆sigB) further affected survival. Transcriptional analysis confirmed the expected effects of the mutations on known Agr- and σB-dependent genes. The ability to colonise the rhizosphere was also significantly compromised in the double mutant. Data highlighted the important role that these global regulatory systems play in the natural ecology of this pathogen.A decrease in cell attachment was observed as a consequence of the Agr system inactivation. Using strains constructed to carry fluorescent reporters of either Agr or σB activity the spatiotemporal regulation of these systems was followed during biofilm formation. Deletion of the Agr system is beneficial for biofilm production under osmotic stress. Results also suggested a role for σB in biofilm formation that depended on the environmental conditions encountered. Delayed expression of agrA was shown in the ∆sigB background. Deletion of sigB resulted in no activation of agr in biofilm produced under osmotic stress. Overall, both Agr and σB systems were found to contribute to L. monocytogenes biofilm formation.Using a combination of in silico and in vivo approaches, a binding interaction was predicted between the σB-dependent sRNA Rli47 and the Shine-Dalgarno region of the ilvA mRNA, which encodes threonine deaminase, an enzyme required for branched-chain amino acid biosynthesis. Both ilvA transcript levels and threonine deaminase activity were increased in the ∆rli47 mutant. The ∆rli47 mutant displayed a shorter growth lag in isoleucine-depleted media than the WT, and a similar phenotype was also observed in a mutant lacking σB. RNA-seq analysis uncovered a significant role for Rli47 in modulating amino acid metabolism. The data point to a model where Rli47 is responsible for specifically repressing isoleucine biosynthesis as a way to restrict growth under harsh conditions, contributing to the survival of L. monocytogenes in niches both outside and within the mammalian host.The diversity of global regulators as well as the crosstalk between the various regulatory systems in L. monocytogenes add complexity to its transcriptional networks under the most diverse environments. Understanding how individual stress signals are sensed and transcriptomic rearrangements achieved for a quick adaptation response might be a critical step in helping to develop strategies to prevent L. monocytogenes growth, survival, and dissemination.


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