Les mécanismes moléculaires de résistance des cellules de mélanome à l’attaque des lymphocytes T cytotoxiques à la synapse immunologique

Molecular mechanism of melanoma cells resistance to cytotoxic T lymphocytes attack at the immunological synapse

• Auteur / Autrice : Liza Filali
• Direction : Salvatore Valitutti, Laurence Lamant-Rochaix
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Immunologie
• Date : Soutenance le 19/12/2019
• Etablissement(s) : Toulouse 3
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie Santé Biotechnologies (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de Recherche en Cancérologie de Toulouse (2011-....)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Réponse immunitaire

Lymphocytes T cytotoxiques

Mélanome

Mots clés libres

Lymphocyte T cytotoxique

Mélanome

Synapse immunologique

Lysosomes

Cytotoxic T lymphocyte

Melanoma

Immunological synapse

Lysosomes

Résumé

Les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) jouent un rôle essentiel dans la réponse immunitaire contre les cellules tumorales. Ils induisent l'apoptose de leurs cellules cibles par la sécrétion de granules lytiques dans une zone spécialisée appelée synapse immunologique (SI). Cette capacité lytique place les CTL au cœur de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à améliorer la réponse immunitaire des patients contre les cellules tumorales. Ces stratégies sont prometteuses mais nécessitent encore des améliorations pour être bénéfiques à un plus grand nombre de patients et pour limiter les effets secondaires. Nous avons émis l'hypothèse que l'efficacité limitée des CTL contre les tumeurs est le résultat d'un déséquilibre entre leur capacité à tuer et des mécanismes de résistance à cette attaque, intrinsèque aux cellules tumorales. Pour étudier cette hypothèse, l'équipe s'est concentrée sur les mécanismes moléculaires déclenchés à la SI formée par les CTL et les cellules de mélanome. Cet axe de recherche a conduit à la mise en évidence de la résistance des cellules de mélanome à l'attaque des CTL par un nouveau mécanisme de défense qui passe par la sécrétion de leurs lysosomes, entraînant une dégradation de la perforin à la synapse lytique (SL). Mon projet visait à comprendre la cinétique de réponse et les mécanismes moléculaires impliqués dans cette défense synaptique. Tout d'abord, par une approche de cytométrie en flux, nous avons pu démontrer que la formation de pores par la perforine déclenche des mécanismes de réparation membranaire dans les cellules de mélanome. Puis par une approche de microscopie en temps réel, nous avons observé que ces mécanismes sont localisés dans la zone de contact avec les CTL. Nous nous sommes ensuite intéressés au signal permettant aux cellules de mélanome de détecter l'attaque du CTL, nous avons pu mettre en évidence, par vidéomicroscopie ultra-rapide, la formation de gradients de Ca2+ qui démarrent à la SL, au cours des premières minutes de contact avec le CTL par les pores formés par la perforine à la membrane plasmique. Nous nous sommes donc intéressés à l'étude de la cinétique et de la localisation de l'exposition des lysosomes par les cellules de mélanome durant ces premières minutes. Pour cela, nous avons exprimé dans des cellules de mélanome le marqueur de lysosome CD107a couplé à une protéine fluorescente sensible au pH. Ces expériences permettant de visualiser en temps réel l'exposition lysosomale à la membrane plasmique ont montré que dès les premières minutes de contact, les cellules de mélanome sont capables d'exposer rapidement leurs lysosomes à la SL, avant même la polarisation complète de la machinerie lytique du CTL. Enfin, nous avons pu mettre en évidence que l’altération de la signalisation calcique par traitement pharmacologique ou par la diminution de l’expression de la synaptotagmine VII (une protéine SNARE Ca2+ dépendante) augmente la sensibilité des cellules de mélanome à l’attaque des CTL. L’ensemble de ces résultats démontrent que les cellules de mélanome utilisent des mécanismes de réparation membranaire pour se défendre rapidement de l’attaque des CTL. Ils mettent également en évidence un rôle protecteur inattendu de la signalisation calcique dans les cellules tumorales. Enfin, cette étude révèle une nouvelle implication de la sécrétion lysosomale dans la résistance des tumeurs à la surveillance immunitaire. Interférer avec la résistance synaptique des cellules de mélanome pourrait ainsi être une stratégie complémentaire aux stratégies thérapeutiques actuelles visant à potentialiser l'activité du CTL afin d’améliorer leur efficacité.

Cytotoxic T lymphocytes (CTL) play an essential role in the immune response against tumor cells. They induce apoptosis of target cells by secretion of their lytic granules in a specialized area named the immunological synapse. This lytic ability places CTLs at the heart of new therapeutic strategies to improve patients' immune responses against tumor cells. These strategies are promising but still need to be improved to be beneficial to a higher number of patients and to limit side effects. We hypothesize that the limited efficacy of CTLs against tumors is the result of an imbalance between their ability to kill and intrinsic resistances mechanisms of tumor cells. To investigate this hypothesis, the team focused on molecular mechanisms triggered at the immunological synapse formed by CTLs and melanoma cells. This line of research has led to the discovery of melanoma cells resistance to the attack of CTLs at the lytic synapse through a new defense mechanism, via the secretion of their lysosomes, leading to perforin degradation at the lytic synapse. My project aimed to better understand the time kinetics and the molecular mechanisms involved in this synaptic defense. First, through an optimized flow cytometry approach, we were able to show that pore formation by perforin triggers membrane repair mechanisms in melanoma cells. Using live cell time-lapse microscopy, we observed that these mechanisms are taking place in the contact area with CTLs. In order to determine the signal allowing melanoma cells to sense CTL attack, we studied using ultra-rapid time-lapse microscopy Ca2+ entry in melanoma cells via the plasma membrane pores induced by perforin. These experiments allowed us to show the formation of Ca2+ gradients starting at the lytic synapse, during the first minutes of contact with CTL. We were therefore interested to study the time kinetics and localization of lysosome exposure by melanoma cells during these first minutes. To do this, we expressed in melanoma cells CD107a coupled to a pH-sensitive fluorescent protein. These experiments allowing to visualize in real time lysosomal exposure on the plasma membrane, showed that since the first minutes of contact, melanoma cells are able to rapidly expose their lysosomes at the lytic synapse, even before the complete polarization of CTL's lytic machinery. Finally, we observed that melanoma cells pretreatment with a Ca2+ chelator and silencing synaptotagmin VII expression (a Ca2+ dependent protein involved in lysosome secretion) increase melanoma cells sensitivity to CTL attack. These results demonstrate that melanoma cells use membrane repair mechanisms to rapidly defend themselves from CTL attack. They also highlight an unexpected protective role of calcium signaling in tumor cells. Finally, in its whole, our study highlights a new implication of lysosome secretion in the resistance of tumors to immune surveillance. Interfering with the synaptic resistance of melanoma cells could synergize with current therapeutic strategies aiming at potentiating CTL activity and thus provide benefit to melanoma patients.