Quantitative analysis of the regulation of the DNA replication program by the intra-S phase checkpoint in Xenopus embryos

par Diletta Ciardo

Thèse de doctorat en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Kathrin Marheineke et de Arach Goldar.

Le président du jury était Sébastien Bloyer.

Le jury était composé de Kathrin Marheineke, Arach Goldar, Sébastien Bloyer, Jean-Charles Cadoret, Annick Lesne, Laure Crabbé.

Les rapporteurs étaient Jean-Charles Cadoret, Annick Lesne.

  • Titre traduit

    Analyse quantitative de la régulation du programme de réplication de l'ADN par le point de contrôle intra phase S dans les embryons de Xénope


  • Résumé

    Dans les organismes multicellulaires, plusieurs millier d’origines initient la réplication de l'ADN. Elles sont regroupées en domaines qui se répliquent tôt ou tard au cours de la phase S (origines précoces ou tardives). L'un des mécanismes régulant le programme de réplication est un point de contrôle intra phase S qui dépend des kinases ATR et Chk1. Cette voie est activée par un stress réplicatif engendré par le blocage des fourches de réplication aux origines précoces, en retour elle inhibe l’activation des origines tardives. Il a été proposé, que la protéine Polo-Like-Kinase 1 (Plk1) soit responsable du déclenchement des origines situées à proximité des fourches bloquées en cas de stress réplicatif. Cependant, aucune analyse de l’activation des origines n’a jamais été réalisée au cours d’une phase S non perturbée lorsque Plk1 est absente. Pour avoir une vue globale et unifiée du processus de réplication de l'ADN, des modèles numériques et analytiques ont été construits dans le passé, mais aucun d'eux n'intègrent le rôle de Chk1 et Plk1. L'objectif de ma thèse était d’étudier expérimentalement et analytiquement de quelle manière Chk1 peut réguler le déclenchement des origines dans l'espace et dans le temps. En particulier, de comprendre si Plk1 pouvait être impliquée dans cette régulation pendant une phase S non perturbée, à cette fin, j'ai utilisé le système réplicatif des extraits d’œuf de Xénopes. En premier lieu, j'ai intégré dans un modèle numérique l’action de Chk1 pour reproduire le programme de réplication du système Xénope. J'ai testé différents scénarios puis j’ai utilisé des données de peignage d'ADN obtenues précédemment dans des conditions d'inhibition de la kinase Chk1. Les simulations Monte Carlo obtenues ont été ajustées aux données expérimentales en optimisant les valeurs des paramètres libres des modèles. J'ai trouvé qu'il fallait ajouter deux hypothèses aux modèles de réplication développés précédemment: 1) la présence d’une forte inhibition du déclenchement des origines par Chk1 à partir du début de la phase S 2) la présence de domaines génomiques répliquant précocement et qui échappent à cette inhibition. Deuxièmement, j'ai montré expérimentalement que, Plk1 actif est recrutée sur la chromatine avant le début de la phase S non perturbée et qu'en l'absence de Plk1, la réplication de l'ADN est ralentie. De plus, l’absence de Plk1 entraîne une augmentation de la phosphorylation de Chk1 et une diminution de l’activité de la kinase Cdk2, ce qui suggère que Plk1 inhibe Chk1. En réalisant des expériences de peignage d’ADN, j'ai démontré qu’en l’absence de Plk1 on observe une baisse du niveau d’activation des origines. L'analyse de ces données par mon modèle numérique suggère que Plk1 régule négativement l’action de Chk1 levant ainsi son action inhibitrice sur l’activation globale des origines. Cet effet concorde avec mes observations expérimentales. Il semble cependant que Plk1 n’agisse pas à proximité directe des fourches de réplication, comme cela avait été proposé précédemment. Enfin, en assimilant le processus de réplication à un processus de nucléation et de croissance unidimensionnel, j'ai développé une nouvelle approche quantitative pour étudier la régulation du programme de réplication. Cette approche lie la similarité entre les profils spatiaux de réplication d'une molécule unique et les processus de régulation de la réplication de l'ADN. En analysant les données de peignage d'ADN, j'ai montré que le programme de réplication de l'ADN des embryons précoces de Xénope est régulé par deux processus exclusifs dans l'espace et dans le temps. L’un avec une fréquence faible d’activation des origines et une vitesse apparente de fourches élevée et un second, régulé par Plk1, présentant une fréquence d’activation élevée des origines avec une vitesse apparente de fourches faible.


  • Résumé

    The initiation of DNA replication in multicellular organisms starts from several thousand genomic loci called replication origins. They are grouped into domains which replicate early or late during S phase. The firing of a replication origin creates two diverging replication forks that replicate flanking DNA. One of the mechanisms regulating DNA replication program is the ATR/Chk1 dependent intra-S phase checkpoint. This pathway is activated by replicative stress due to stalled replication forks at early firing origins and in turn, inhibits the late firing of origins. It has been proposed that the checkpoint recovery kinase Plk1 (Polo-Like-Kinase 1) could be responsible for allowing origin firing close to stalled forks in replication stress conditions. However, origin firing has not been analysed after Plk1 inhibition or depletion during unperturbed S phase. To assemble a comprehensive and unified view of the DNA replication process numerical and analytical models have been built in the past, but none of them integrates the role of checkpoint pathways. The goal of my thesis was to investigate experimentally and analytically how the checkpoint regulates the firing of origins in space and time and, in particular, whether the Plk1 is implicated in the regulation of origin firing during unperturbed S phase. To this end, I used the Xenopus in vitro system. First, I integrated in a numerical model the checkpoint pathway to describe the replication program in the Xenopus in vitro system. I tested different scenarios and used DNA combing data previously obtained by the laboratory after the inhibition of the checkpoint kinase Chk1. Monte Carlo simulated data were fitted to experimental data by optimizing the values of free parameters of models using a genetic algorithm. I found that two new hypothesis should be added to formerly built replication models: 1) a strong inhibition of origin firing by Chk1 from the beginning of S phase 2) the presence of early replicating genomic domains that evade the origin firing inhibition. Second, I experimentally showed that during unperturbed S phase active Plk1 is recruited to chromatin before the start of S phase and that in the absence of Plk1, DNA replication is slowed down. Moreover, Plk1 depletion led to an increase in Chk1 phosphorylation (p-Chk1) and a decrease of Cdk2 activity, suggesting that Plk1 inhibits the intra-S phase checkpoint. Performing DNA combing, I demonstrated that Plk1 depletion leads to a decrease in origin firing level. Analysis of the combing data by the developed numerical model suggested that during unchallenged S phase Plk1 down regulates the global origin firing inhibitory action of Chk1, consistent with the experimental observation of increased level of p-Chk1 in Plk1 depleted Xenopus egg extract. However, Plk1 does not seem to act close to replication forks as was proposed earlier. Finally, by considering replication process as a one-dimensional nucleation and growth process and using statistical methods, I developed a new quantitative approach to study the regulation of replication program. This approach links the similarity between single molecule replication patterns to DNA replication regulating processes. By analyzing DNA combing data, I showed that DNA replication program in Xenopus early embryos is regulated by two spatially and temporally exclusive processes. One with low frequency of origin firing and high apparent fork speed and a second, controlled by PlK1, with a high frequency of origin firing and a low apparent fork speed. Altogether my results demonstrate that Plk1 positively regulates replication origin firing during normal S phase by down regulating the replication checkpoint. The numerical model predicts the existence of replication timing domains in the Xenopus model system. Future work will show whether Plk1 regulates the replication program at the level of genomic domains.


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