[60]Fullerène et dérivés : critères de pureté et impact fonctionnel in vivo sur les mitochondries, in vitro et ex vivo sur les cellules de l’allergie

par Sanaz Keykhosravi

Thèse de doctorat en Chimie

Sous la direction de Fathi Moussa.

Le président du jury était Philippe Maître.

Le jury était composé de Fathi Moussa, Philippe Maître, Hassan Allouchi, Samy Gobaa, Pascal Poncet, Ivo B. Rietveld.

Les rapporteurs étaient Hassan Allouchi, Samy Gobaa.


  • Résumé

    En 1985 Kroto décrit le troisième allotrope du carbone, le fullerène, une sphère de 60 carbones d’1nm de diamètre aux caractéristiques physico-chimiques particulières. La réactivité chimique du C₆₀ est dominée par les réactions d’addition et sa grande affinité pour les radicaux libres grâce à ses 30 double-liaisons. Cette propriété a été explorée dans le stress oxydant, tant in vitro qu’in vivo, où l’équilibre redox est impliqué, comme dans les situations pathophysiologiques impliquant l’inflammation et la dégénérescence cellulaire. En particulier, un traitement au C₆₀ solubilisé dans de l’huile a permis de prolonger l’espérance de vie chez le rat. Le produit, commercialisé à travers le monde, n’a pas encore fait l’objet d’essai clinique. D’autre part certaines préparations peuvent contenir des impuretés. Il est donc important d’établir des critères de pureté et d’intégrité des préparations de C₆₀. Ce travail de thèse comporte deux parties. La première, physicochimique, nous a permis d’évaluer la pureté de préparations commerciales de C₆₀ de différentes origines faisant appel à différentes techniques d’analyse: microscopie électronique à balayage, diffraction aux rayons X, calorimétrie différentielle à balayage (DSC), analyse thermogravimétrique, chromatographie liquide (CLHP) ou en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CG-SM), ainsi que la spectroscopie ultraviolet-visible ou infrarouge à transformée de Fourier (FTIR). La DSC est la technique de choix pour établir le critère de pureté et la FTIR la plus rapide. La CG-SM est nécessaire à l’identification des impuretés volatiles, tandis que la CLHP permet de détecter les fullerènes lourds et les dérivés du C₆₀. La deuxième partie a porté sur des aspects fonctionnels des fullerènes et nous avons, pour cela, utilisé des préparations pures selon les critères définis précédemment. Dans un premier temps, nous avons cherché à préciser le sous-compartiment cellulaire ciblé par le C₆₀ injecté in vivo chez la souris. Après administration d’une solution huileuse, les molécules de C₆₀ sont retrouvées dans le foie et la rate, à l’intérieur des cellules, parfois au niveau des mitochondries et du réticulum endoplasmique. La présence des molécules de C₆₀, au niveau des mitochondries a été corroborée par la mise en évidence de modifications spécifiques d’activité des enzymes de la mitochondrie (malate déshydrogénase et complexe I de la chaîne respiratoire). Dans un deuxième temps, nous avons abordé l’effet des fullerènes sur des cellules intervenant dans une dysrégulation immunologique où l’inflammation joue un rôle important : l’allergie. L’évènement cellulaire à l’origine des symptômes allergiques est la libération de médiateurs de l’inflammation et de la réponse immunitaire lors de l’activation dépendante des IgE des basophiles et des mastocytes. L’effet régulateur de C₆₀ et de quatre dérivés hydrosolubles, le fullérol, la β-cyclodextrine C₆₀, le dendro C₆₀ et le C₆₀ serinol-malonate, a été testé. L’innocuité des dérivés à des concentrations nanomolaires et leur pouvoir inhibiteur sur la dégranulation IgE et non IgE dépendante des lignées mastocytaires de rat a été vérifié in vitro. Dans un test d’activation cellulaire mesurant l’expression des marqueurs CD63 et CD203c par cytométrie de flux, nous montrons que les différents dérivés sont capables d’interférer ex vivo avec l’activation de basophiles de patients allergiques dans des conditions naturelles de sang total. Les taux d’inhibition dépendent des dérivés et des patients avec un maximum observé à 35% en présence de C₆₀ serinol-malonate. Ces inhibitions ont été reproduites sur des basophiles humains purifiés en étudiant des marqueurs d’activation supplémentaires CD107a et CD69. Les perspectives de ce travail portent sur la spécificité et les mécanismes d’inhibitions observés au niveau intracellulaire. Elles incluent, par exemple, l’étude des flux de calcium ou des protéines de fusion, ou des facteurs de transcription.

  • Titre traduit

    [60]Fullerene and derivatives : purity criteria and functional impact in vivo on mitochondria, in vitro and ex vivo on allergy related cells


  • Résumé

    In 1985 Kroto discovered the third allotrope of carbon, fullerene, spherical molecule consists of 60 carbons with 1 nm in diameter with a specific physico-chemical characteristic. The chemical reactivity of C₆₀ is governed by addition reactions and its high affinity for scavenging free radicals thanks to its 30 double bonds. This property has been widely explored in the field of oxidative stress, in vitro and in vivo, where redox balance is involved, as physio-pathological situations involving inflammation and cellular degeneration. In particular, treatment with C₆₀ solubilized in olive oil extended life span in a rat experimental model. The product, marketed worldwide, has not yet been clinically tested. On the other hand, some preparations may contain impurities. It is therefore important to establish criteria for the purity and integrity of C₆₀ preparations. This thesis work consists of two parts. In the first physico-chemical part, a criterion of C₆₀ purity was established for evaluating the purity of several commercial preparations of C₆₀ with different origins using the following techniques: scanning electron microscopy, X-ray diffraction, Differential scanning calorimetry (DSC), thermogravimetric analysis (TGA), liquid chromatography and gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS), as well as ultraviolet-visible and Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy. The results show that FTIR is the easiest way to control the quality of C₆₀ and GC-MS is necessary for identifying volatile impurities, while HPLC remains essential for detecting other fullerenes and C₆₀ derivatives. The second part of the thesis deals with functional aspect of fullerenes and for this purpose we used the pure preparation of C₆₀ evaluated according to the previously defined criteria. In a first chapter, to precise the sub-cellular compartment targeted, the C₆₀ dissolved in olive oil were in vivo injected in mice. After administration, C₆₀ molecules were visualized in the liver and in the spleen, inside the cells and sometimes in mitochondria and endoplasmic reticulum. The targeting of [60]fullerene to the mitochondria was confirmed by a specific modification of the activities of mitochondrial enzymes (malate dehydrogenase and complex I of respiratory chain). In a second chapter we studied the effect of fullerenes on cells involved in an immune dysregulation where inflammation plays a role: allergy. The cellular mechanism at the basis of allergic symptoms is the release in circulation and tissues of mediators of inflammation and immune response from IgE-dependent activation of basophiles and mast cells. The regulatory effects of [60]fullerene and 4 hydrosoluble derivatives, fullerol, β-cyclodextrin [60]fullerene, dendro [60]fullerene and [60]fullerene serinol-malonate, were tested. In vitro experiments showed an absence of toxicity at nanomolar concentrations and inhibitory abilities on the IgE-dependent and -independent activation of the rat mast cell line (RBL). In a cellular activation test monitoring the expression of the degranulation and activation markers CD63 and CD203c on basophiles, by flow cytometry, we show that the various fullerenes are able also to inhibit the ex vivo activation of basophiles from peanut allergic patients in a natural physiological environment: in whole blood. Inhibition rates depend on patients and derivatives with a maximum inhibition observed at 35% in presence of [60]fullerene serinol-malonate. These inhibitions were reproduced on purified human basophiles by studying further activation markers CD107a and CD69. Working perspectives will be on the specificity and the mechanisms of inhibition by studying intracellularly calcium influx or the expression of fusion proteins and transcription factors.



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