Adaptation génétique des bactéries methylotrophes à la production industrielle des composés chimiques

par Sophia Belkhelfa

Thèse de doctorat en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Marcel Salanoubat.

Soutenue le 12-03-2019

à Paris Saclay , dans le cadre de Structure et Dynamique des Systèmes Vivants , en partenariat avec Génomique Métabolique (Evry, Essonne) (laboratoire) et de Université d'Évry-Val-d'Essonne (établissement opérateur d'inscription) .

Le président du jury était Matthieu Jules.

Le jury était composé de Volker Döring, Rodrigo Ledesma Amaro, Denis Thibaut.

Les rapporteurs étaient Françoise Bringel, Olivier Tenaillon.


  • Résumé

    Ce projet a pour objectif l'amélioration de souches châssis méthylotrophes capables de convertir le méthanol fourni comme source de carbone et d'énergie en biomasse et, à terme, en composés chimiques dans les conditions de production industrielle. Le méthanol est une alternative aux glucides en tant que matière première pour les fermentations industrielles, car son utilisation n'entre pas en concurrence avec les denrées alimentaires et il peut être produit par réduction chimique du CO2.Une condition préalable à la production efficace à grande échelle de composés d'intérêt est la stabilité de la souche méthylotrophe productrice dans des concentrations élevées de méthanol. À cette fin, deux souches méthylotrophes apparentées, Methylobacterium extorquens AM1 et TK 0001, qui croissent de façon optimale avec 1% de méthanol, ont été adaptées en culture continue à la prolifération en présence de concentrations de méthanol allant jusqu'à 10%. Ces adaptations ont été réalisées à l'aide des automates de culture GM3, qui permettent de maintenir des populations de microorganismes en croissance à long terme dans des conditions contrôlées.Les courbes de croissance enregistrées pour des isolats issus de populations évoluées ont montré une prolifération accrue en présence de 5 % de méthanol en comparaison avec les cellules non évoluées. Les isolats croissent de façon comparable mais non identique, ce qui suggère une hétérogénéité des cellules adaptées dans une même population.Le séquençage génomique de clones isolés à différentes étapes de l'évolution en concentration croissante de méthanol a révélé des profils mutationnels variés. En revanche, le gène metY codant pour la O-acétyl-L-homosérine sulfhydrylase est muté dans tous les isolats. L'enzyme codée catalyse une réaction secondaire en présence de méthanol produisant la méthoxinine, analogue de la méthionine, connue pour sa toxicité par son incorporation dans les protéines. Les résultats des tests enzymatiques réalisés sur les protéines MetY mutées montrent une perte de fonction presque complète avec le méthanol ainsi qu'avec les substrats naturels, suggérant la participation de MetY dans la toxicité du méthanol.Une analyse transcriptomique a été entreprise afin d'étudier l'expression génique de la souche évoluée G4105 de M. extorquens TK 0001 en réponse à une exposition brève ou prolongée à une concentration élevée de méthanol en comparaison avec la réponse de la souche sauvage. Les gènes impliqués dans la division cellulaire, la structure des ribosomes et des flagelles, la stabilité des protéines et l'absorption du fer montrent une différence d'expression entre les deux souches.Les variantes de M. extorquens TK 0001 adaptées à une concentration élevée de méthanol produisent plus de biomasse à partir de méthanol que les cellules de type sauvage. On peut supposer qu'un composé synthétisé via une voie dérivant du métabolisme central par des cellules adaptées pourrait être produit à partir de méthanol avec un rendement supérieur à celui atteint par des cellules de type sauvage. La production de D-lactate a été testée dans les souches sauvage et évoluée sur-exprimant la lactate déshydrogénase endogène. Les cellules évoluées produisent plus de lactate que la souche contrôle, confirmant ainsi l'intérêt de cette adaptation au méthanol.

  • Titre traduit

    Genetic adaptation of methylotrophic bacteria for industrial production of chemical compounds


  • Résumé

    The objective of this project was the development of enhanced methylotrophic chassis strains capable of converting methanol as carbon and energy source into biomass and ultimately into commodity chemicals under industrial conditions. Methanol is an alternative to carbohydrates as feedstock in industrial biotechnology as its use does not interfere with food supply and its production can start from CO2.A prerequisite for an efficient and large scale industrial fermentation is stable growth of the methylotrophic producer strain on high methanol concentrations. For this purpose, two closely related methylotrophic strains, Methylobacterium extorquens AM1 and TK 0001, which both have a growth optimum at about 1% methanol, were adapted in continuous culture to proliferate stably in the presence of methanol of up to 10% (v/v). The adaptations were conducted using GM3 devices enabling automated long term cultivation of microorganisms.Growth curves recorded for isolates obtained from evolved populations showed enhanced proliferation in the presence of methanol at 5% as compared with wild type cells. The isolates showed comparable albeit not identical growth pointing to heterogeneity among the adapted cells in the population.Genomic sequencing of isolated clones at different steps of the adaptation revealed differences in their mutation profiles. The gene metY coding for O-acetyl-L-homoserine sulfhydrylase was found to be mutated in all isolates. This enzyme undergoes a side reaction with methanol leading to the production of the methionine analogue methoxinine known to be toxic through incorporation into proteins.Enzymatic tests conducted with these mutants showed an almost complete loss of activity even with their natural substrates, validating the involvement of MetY in methanol toxicity.Transcriptomic analysis was performed to study the gene expression response of an evolved derivative of M. extorquens TK 0001 to short and long term exposure to high methanol and compared with the response of the ancestor strain. Genes implicated in cell division, ribosomal and flagellar structures, protein stability and iron uptake showed differences in expression patterns between the strains.The M. extorquens TK 0001 cells adapted to high methanol produced more biomass from methanol than the wildtype cells. This suggests that a compound synthesized through a pathway branching from the central metabolism would be produced in higher yield from methanol by the adapted cells compared to the wildtype cells. The production of D-lactate was tested for wildtype and evolved cells both overexpressing native lactate dehydrogenase. The evolved cells produced more lactate than the control cells, confirming the interest of this methanol adaptation.

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