Hydrogel poreux pour la reconstruction osseuse : élaboration, caractérisation et mise en œuvre dans un bioréacteur à perfusion

par Jérôme Grenier

Thèse de doctorat en Génie des procédés

Sous la direction de Hervé Duval, Bertrand David et de Didier Letourneur.

Le président du jury était Christophe Egles.

Le jury était composé de Sylvain Deville, Luc Picton, Caroline Gentric, Paul Menut.

Les rapporteurs étaient Sylvain Deville, Luc Picton.


  • Résumé

    La reconstruction de larges défauts osseux nécessite l’implantation de matrices jouant le rôle d’échafaudage, biocompatibles, biodégradables et capables de promouvoir la régénération osseuse. Cette thèse porte sur un biomatériau poreux dont certaines formulations ont déjà démontré leur potentiel de régénération osseuse chez le rat et la chèvre. Il est obtenu par lyophilisation d’un hydrogel de polysaccharides (pullulane et dextrane) réticulé chimiquement.Dans un premier temps, on s’intéresse à l’influence des paramètres du procédé d’élaboration sur la structure poreuse du biomatériau. Les matrices sont caractérisées à chaque étape du procédé : par rhéométrie en mode dynamique lors de la réticulation, par cryomicroscopie électronique à l’issue de la congélation, par microtomographie à rayon X à l’état déshydraté et enfin par microscopie confocale à l’état solvaté. Il apparaît que la structure poreuse obtenue à l’issue de la lyophilisation dépend fortement de la microstructure de la glace formée lors de l’étape de congélation : chaque pore résulte de la croissance d’un à quelques cristaux. Le nombre et la taille des grains de glace après solidification complète sont étroitement liés à la germination secondaire, un phénomène qui est exacerbé par la présence du réseau polymère.Deux paramètres d’élaboration contrôlant la structure poreuse sont particulièrement examinés : d’une part la quantité de réticulant introduit lors de la synthèse de l’hydrogel (qui modifie la longueur de corrélation du réseau polymère), d’autre part la température de germination lors de la congélation. Après sublimation de la glace, le biomatériau obtenu est extrêmement poreux (92 − 94%).L’efficacité d’ensemencement des matrices déshydratées est quantifiée à l’aide de suspensions de microsphères de différents diamètres et de suspensions de cellules : le seuil de coupure est de l’ordre du diamètre moyen des pores secs. Après hydratation (concomitante à l’ensemencement), la porosité est nettement plus faible (~ 30%) et le diamètre moyen des pores hydratés diminue d’un facteur 2 à 4 en fonction de la densité de réticulation.Dans un second temps, cette thèse met en place une démarche d’étude in vitro portant sur les interactions des cellules osseuses (ostéoblastes de souris) avec le biomatériau. L’objectif est de disposer d’un système d’étude mimant les conditions physiologiques afin d’optimiser les propriétés de régénération osseuse du biomatériau. Le choix d’un dispositif in vitro permet de faire l’économie d’expérimentations animales. Un bioréacteur à perfusion est choisi comme modèle d’étude car il permet un environnement 3D où les transferts de matière peuvent être contrôlés. Une caractérisation multi-échelle est mise en place : marquage biologique et microscopie confocale à l’échelle des amas cellulaires et des matrices, imagerie par résonnance magnétique à l’échelle du bioréacteur. Celle-ci est complétée par la simulation numérique de l’hydrodynamique et du transport d’oxygène dissous dans le bioréacteur où chaque phase (fluide, hydrogel, amas cellulaires) est décrite avec une résolution spatiale de 55 µm correspondant à celle de l’IRM. Les équations de Navier-Stokes et l’équation de convection-diffusion sont simulées à l’aide de méthodes de Boltzmann sur réseau, particulièrement adaptées aux géométries complexes. On étudie l’influence de la taille des amas cellulaires et de la densité d’amas sur le champ de concentration d’oxygène en vue d’optimiser leur viabilité.Cette thèse donne des éléments clés pour contrôler la microstructure d’un hydrogel poreux destiné à l’ingénierie tissulaire et fournit un protocole expérimental d’étude en bioréacteur à perfusion couplé à une modélisation numérique pour optimiser les propriétés d’usage du biomatériau.

  • Titre traduit

    Porous hydrogel scaffolds for bone repair : fabrication, characterization and validation in a perfusion bioreactor


  • Résumé

    The reconstruction of large bone defects requires the implantation of scaffolds that are biocompatible, biodegradable and able to promote bone healing. This thesis focused on a porous biomaterial that had already demonstrated its osteo-inductive properties after implantation in rats and goats. This biomaterial is produced by freeze-drying of a chemically crosslinked polysaccharide-based (pullulan and dextran) hydrogel.First, we studied the influence of the process parameters on the properties of the biomaterial porous structure. The scaffolds were characterized at each step of the fabrication process: by dynamic rheometry during crosslinking, by electron cryo-microscopy just after freezing, by X-ray microtomography in the dry state and finally by confocal microscopy in the swollen state. It appears that the porous structure obtained at the end of freeze-drying strongly depends on the microstructure of the ice formed during the freezing stage: each pore results from the growth of one to a few crystals. Ice grains are mostly generated by secondary nucleation, this phenomenon is enhanced by the presence of the polymer network. Two parameters controlling the porous structure were particularly examined: the amount of crosslinker that reacts with the polysaccharides (which affects the correlation length of the polymer network), and the nucleation temperature at the onset of freezing. After sublimation of ice, the biomaterial becomes highly porous (92-94%).The seeding efficiency of the dried scaffolds was quantified using suspensions of narrow-sized calibrated microspheres and suspensions of cells: the seeding threshold is in the order of the average diameter of the dry pores. After swelling (occurring simultaneously with seeding), porosity is significantly lower (~ 30%) and the average diameter of the swollen pores is 2 to 4 times lower than in the dry state (depending on the crosslink density).Secondly, we investigated in vitro the interactions between the porous hydrogel scaffolds and osteo-competent cells derived from a mouse cell line. The experimental device was designed in order to mimic the physiological conditions. A perfused bioreactor was chosen because of its ability to generate a 3D environment with controlled shear stress and controlled solute concentration. Such a system should help to optimize the biomaterial while reducing the use of animal experiments. A multiscale characterization of the bioreactor tests was implemented: use of biomarkers and confocal microscopy at the spheroid and scaffold scales, magnetic resonance imaging at the bioreactor scale. We also investigated the hydrodynamics and the transport of oxygen within the bioreactor using computational fluid dynamics: fluid, hydrogel and spheroids were described at the MRI spatial resolution (i.e. 55 µm), NavierStokes equations and advection-diffusion equation were simulated using lattice-Boltzmann methods. These methods are indeed particularly suitable for complex geometries. The influence of organoid size and density on the oxygen concentration field was studied to optimize cell viability.This thesis provides key elements to control the microstructure of the porous hydrogel scaffolds and proposes a workflow to optimize the bone healing properties of the biomaterial by coupling tests in perfused bioreactors, experimental characterizations and numerical modelling.

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