Improvement of the molecular classification of benign hepatocellular tumors : towards the implementation of diagnostic tools
Amélioration de la classification moléculaire des tumeurs hépatocellulaires bénignes : vers la mise en place d’outils diagnostiques
Résumé
Hepatocellular adenomas (HCA) are rare benign tumors defined according to the presence of inactivating mutations of HNF1A, activating mutations of the CTNNB1 and IL6/JAK/STAT pathway activation. However, a small number of HCA remain without specific characteristics. We aim to refine the molecular classification of HCA and identify potential associations with the clinical and molecular characteristics of each subgroup of HCA. For this purpose, we collected of 533 HCA of 411 patients. We sequenced the 10 genes known to be mutated in HCA, and we analyzed by quantitative RT-PCR the expression of 20 genes significantly deregulated in the differents moleculars groups of HCA, allowing us to classify HCA according to their genetic and molecular alterations. However, 11% of HCA remained unclassified (U_HCA). In order to identify the genetic and molecular alterations involved in the tumorigenesis of these U_HCA, we analyzed the RNAseq profiles and compared the expression profiles of 4 normal livers and 36 adenomas from differents moleculars groups. A microdeletion of the INHBE gene leading to the formation of a gene fusion between the INHBE gene and exons 2 and 4 of the GLI1 gene, a transcription factor of the Sonic Hedgehog pathway (Hh), has been identified. In addition, the GSEA study, showed an enrichment of the Hh pathway genes in half of the U_HCA analized. We therefore identified a new subgroup of AHC (sh_HCA, 4%), characterized by the activation of the Hh pathway characterized to the presence of an INHBE-GLI1 gene fusion. The comparison of the histological, clinical and molecular characteristics of each of the HCA subgroup allowed us to refine our knowledge of the risk factors, clinical and histological characteristics related to each molecular group. We showed that the new sh_HCA adenoma subgroup was associated with a higher risk of histological and clinical bleeding. A proteomic study of HCA proposed ASS1 as a marker for HCA at high risk of bleeding. Interestingly, a study on hepatic metabolic zonation showed that ASS1 is a marker of the periportal zone of the hepatic lobule. We therefore sought to evaluate the importance of the level of expression of the ASS1 in the molecular classification of HCA and its involvement following the activation of the Hh pathway. In our series of HCA, we showed that the expression of ASS1 belonged to the periportal expression program that was maintained in sh_HCA while in the other subtypes of HCA, it was under-expressed. In addition, in contrast to sh_HCA, we identified the activation of the perivenous program in b_HCA with Wnt/ β-catenin activation. We performed a functional study by transfecting cell lines either by inhibiting the expression of the GLI1 gene. Inhibition by siRNA of GLI1 gene expression in cell lines induces negative regulation of the ASS1 gene. This study shows the importance of the molecular classification of HCA. Indeed, the improvement of this classification allowed the identification of a new subgroup of HCA, the sh_HCA, adenomas presenting a hemorrhagic risk. These findings highlight for the first time the involvement of the Sonic Hedgehog pathway in benign liver tumorigenesis and hepatic zonation in humans. Finally, this new classification could be useful in clinical practice to customize treatement to individual patients based on the molecular characteristics of the tumors.
Les adénomes hépatocellulaires (AHC) sont des tumeurs bénignes rares répartit selon la présence de mutations inactivatrices d’HNF1A, de mutations activatrices du gène CTNNB1 codant pour la ß-caténine et l’activation de la voie IL6/JAK/STAT. Toutefois, un faible nombre d’AHC reste sans caractéristiques spécifiques. Nous avons cherché à affiner la classification moléculaire des AHC et à identifier les associations existantes entre les caractéristiques cliniques et moléculaires de chaque sous-groupes d’AHC. Pour cela, un recrutement de 533 AHC pour 411 patients a été réalisé. Nous avions procédé au séquençage des 10 gènes connus pour être mutés dans les AHC, et analysé par RT-PCR quantitative l’expression de 20 gènes significativement déréguler dans les différents groupes moléculaires d’AHC. L’ensemble de ces résultats, a permis de classer les AHC selon leurs altérations génétiques et moléculaires. Cependant, 11% des AHC restaient inclassés (U_HCA). Afin d’identifier les altérations génétiques et moléculaires impliquées dans la tumorigenèse de ces U_AHC, nous avons analysé les profils RNAseq et comparé les profils d’expression de 4 foies normaux et 36 adénomes des différents groupes moléculaires. Une micro délétion du gènes INHBE conduisant à la formation d’un gène fusion entre le gène INHBE et les exons 2 et 4 de du gène GLI1, facteur de transcritption de la voie Hh, a été identifié. Par ailleurs, l’étude GSEA, des gènes spécifiquement surexprimés dans ces AHC a montré un enrichissement des gènes de la voie de la voie Sonic Hedgehog (Hh) dans la moitié des U_HCA étudiés. Nous avons donc identifié un nouveau sous-groupe d’AHC (sh_AHC, 4%), caractérisé par l’activation de la voie Sonic Hedgehog secondaire à la présence d’un gène de fusion INHBE-GLI1. La confrontation des caractéristiques histologiques, cliniques et moléculaires de chacun des 4 groupes d’AHC a permis d’affiner notre connaissance des facteurs de risque, des caractéristiques cliniques, histologiques lié à chaque groupe moléculaire. Nous avons montré que le nouveau sous-groupe d’adénome sh_AHC est associé un à risque plus élevé d’hémorragie histologique et clinique. Une étude protéomique des AHC a proposé ASS1, comme marqueur des AHC présentant un risque élevé d’hémorragie. De manière intéressante, une étude sur la zonation métabolique hépatique, a démontré que ASS1 est un marqueur de la zone périportale du lobule hépatique. Nous avons donc cherché à évaluer l'importance du niveau d’expression du gène ASS1 dans la classification moléculaire des AHC et son implication suite à l’activation de la voie Hh. Dans notre série d’AHC, nous avons montré que le niveau d’expression d’ASS1 appartenait au programme d'expression périportal qui était maintenu dans sh_AHC tandis que dans les autres sous-types de AHC, il été sous-exprimé. De plus en opposition au sh_AHC, nous avons montré l’activation du programme périveineux dans les b_AHC activés pour la voie Wnt/ β-catenin car la voie est connue pour être impliqué dans le zonation hépatique et dans le maintien du niveau d’expression des gènes du réseau périveineux. Nous avons effectué une étude fonctionnelle en transfectant des lignées cellulaires soit en inhibant l’expression du gène GLI1. L’inhibition par siRNA de l’expression du gène GLI1 dans les lignées cellulaires, induit une régulation négative du gène ASS1. Cette étude montre l’importance de la classification moléculaire des AHC. En effet, l’amélioration de cette classification a conduit à identifier un nouveau groupe d’AHC, les sh_AHC, adénomes présentant un risque hémorragique. Cette découverte souligne pour la première fois l’implication de la voie Sonic Hedgehog dans la tumorigénèse hépatique bénigne et dans la zonation hépatique chez l’homme. L’identification de ces tumeurs permettra de proposer des prises en charge à la carte adaptée au profil moléculaire des tumeurs en pratique clinique.
Origine : Version validée par le jury (STAR)
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