Conception de nouveaux biocatalyseurs par fusion de domaines catalytiques

par Mamy Hery Ny Aina Rabeharindranto

Thèse de doctorat en Ingenieries microbienne et enzymatique

Sous la direction de Gilles Truan.

Soutenue le 08-07-2019

à Toulouse, INSA , dans le cadre de École Doctorale Sciences Écologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries (Toulouse) , en partenariat avec Toulouse Biotechnology Institute/TBI (laboratoire) et de Toulouse Biotechnology Institute / TBI (laboratoire) .

Le président du jury était Laura Baciou.

Le jury était composé de Gilles Truan, Muriel Gondry, Thomas Lautier, Vincent Courdavault.

Les rapporteurs étaient Laura Baciou, Muriel Gondry.


  • Résumé

    La production microbienne de molécules d'intérêt pourrait être améliorée par des stratégies d'ingénierie du vivant. L'ingénierie enzymatique joue un rôle central dàns la conception d'organismes hôtes efficaces car l'efficacité de la voie dépend en premier lieu de l'efficacité des enzymes. Aujourd'hui, il est utile de savoir quelles conceptions d'enzymes synthétiques sont efficaces et quels paramètres doivent être testés pour les caractériser. La colocalisation spatiale d'enzymes à l'intérieur de la voie métabolique pourrait améliorer la production de la molécule d'intérêt finale en permettant une biotransformation rapide des intermédiaires de la voie de biosynthèse. Des protéines multidomaines regroupant plusieurs activités enzymatiques sont décrites dans la littérature. Ces travaux ont permis la création de fusions synthétiques d'enzymes caroténogéniques pour la production de bêta-carotène chez Saccharomyces cerevisiae. Différents types de fusions et de configurations enzymatiques ont été testés. L'étude a permis ia création d'une fusion enzymatique tripartite efficace produisant deux fois moins d'intermédiaires et deux fois plus de bêta-carotène. Les mesures précises de la concentration de chaque caroténoïde, associées à la quantification des enzymes, ont permis de caractériser l'efficacité de chaque enzyme synthétique. D'autres stratégies de colocalisation spatiale d'enzymes ont également été testées en utilisant des domaines d'interaction tels que la cohesinedockérine ou la protéine oligomériques CcmK2. Certaines enzymes caroténogéniques préservent leur fonctionnalité au sein de ces configurations. Des systèmes enzymatiques construites modifient le flux métabolique des caroténoïdes et produisent des caroténoïdes différents de ceux des enzymes naturelles. Un contrôle plus affiné des activités enzymatiques pourrait permettre un contrôle précis de la nature du caroténoïde final produit

  • Titre traduit

    Design ofbiocatalysts by domain fusion and scaffolding


  • Résumé

    Microbial production of molecules of interest can be improved by severa! engineering strategies. Enzymatic engineering has a central role in the conception of efficient host because pathway's efficiency depends in first place on the efficiency of the enzymes. Knowing which synthetic enzymes conceptions are efficient and knowing to characterize the best candidates are essential. Enzyme colocalisation inside metabolic pathway might improve the production of final molecule of interest by allowing rapid biotransformation of intermediates of the pathway. Multidomain proteins regrouping severa! enzymatic activities are described in the literature. This work has focused in part on the creation of synthetic fusion of sorne carotenogenic enzymes for the production of beta carotene in Saccharomyces cerevisiae. Different types of enzymatic fusions and configurations have been tested and. characterized. The study allowed the creation of an efficient tripartite enzyme. fusion which produces two times Jess intermediates and two times more beta carotene. Precise measurement of each caro teno id' s concentration coupled with quantification of enzymes allows the characterization of the efficiency of each synthetic enzyme. Other strategies for enzyme spatial co localisation have also been tested using domains of interaction like cohesin-dockerin or the oligomeric protein CcmK2. Sorne carotenogenic enzymes are still functional using those configurations. Sorne of the enzymatic systems modify the metabolic flow ofcarotenoids and produce carotenoids different from the natural systems. Sorne strategies have changed the metabolic flux of carotenoids inside the pathway. Interestingly, a fine control of activity of enzyme might allow a fine control of the nature of the final carotenoid


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