Caractérisation de protéines fluorescentes photoconvertibles pour la microscopie super-résolution par localisation de molécules uniques

par Daniel Thédié

Thèse de doctorat en Biologie structurale et nanobiologie

Sous la direction de Dominique Bourgeois.

Le président du jury était Guy Royal.

Le jury était composé de Dominique Bourgeois, Aleksandra Radenovic, Jean-Baptiste Sibarita, Ilaria Testa, Emmanuel Margeat.

Les rapporteurs étaient Aleksandra Radenovic, Jean-Baptiste Sibarita.


  • Résumé

    La microscopie de fluorescence est une puissante technique pour l'observation d'échantillons biologiques et la compréhension de processus moléculaires. Les deux dernières décennies ont été témoins de grandes avancées dans ce domaine, notamment avec le développement des techniques de "super-résolution", qui permettent l'observation de structures plus fines que la limite de diffraction de la lumière visible (~200 nm). Une de ces techniques les plus populaires est le PALM (Photoactivated Localisation Microscopy, microscopie par localisation photoactivée), qui utilise des protéines fluorescentes phototransformables (PTFPs) pour observer des molécules uniques, et les localiser avec une précision de 10-20 nm. Les PTFPs sont des protéines de la même famille que la GFP (Green Fluorescent Protein, protéine fluorescente verte), qui non-seulement produisent de la fluorescence, mais peuvent aussi subir des réactions photo-induites, comme l'activation de fluorescence ou le changement de couleur d'émission. Ces propriétés sont à la base du PALM, puisqu'elle permettent la séparation temporelle stochastique des émissions de fluorescence, et l'imagerie de molécules uniques. Le fait que le PALM détecte des molécules uniques a conduit au développement d'un grand nombre d'applications, dont le sptPALM (single-particle tracking PALM, suivi de molécules uniques en PALM) et le PALM quantitatif (qPALM). Ces applications avancées permettent déjà d'acquérir des informations précieuses sur le fonctionnement des systèmes biologiques, mais leur utilisation reste difficile. Une des raisons en est le comportement photophysique complexe des PTFPs, qui va au-delà des transformations utiles pour l'imagerie PALM.L'objet de cette thèse était donc de caractériser les réactions photo-induites subies par les protéines fluorescentes photoconvertibles (PCFPs, qui sont parmi les marqueurs les plus populaires en PALM), dans le but d'améliorer les approches de suivi de molécules uniques et quantitatives en PALM. En particulier, ce travail cherchait à comprendre les pertes transitoires de fluorescence, connues sous le terme de scintillement (blinking en anglais), qui sont détrimentales aux expériences PALM. Une caractérisation poussée des réactions photo-induites ayant lieu dans les formes verte et rouge de la PCFP étudiée nous a suggéré une stratégie pour réduire l'influence du scintillement, et des artéfacts qu'il produit. Enfin, cette stratégie a été appliquée à une expérience de qPALM.Ce travail constitue un pas en avant vers une meilleure compréhension de la photophysique des PCFPs, et une meilleure extraction d'informations quantitatives des données PALM.

  • Titre traduit

    Characterisation of photoconvertible fluorescent proteins for single-molecule localisation microscopy


  • Résumé

    Fluorescence microscopy is a powerful tool for the observation of biological specimens and the understanding of molecular processes. The last two decades have seen tremendous advances in the field, notably with the development of “super-resolution” techniques, which allow the observation of structures smaller than the diffraction limit of visible light (~200 nm). One of the most popular of these techniques is Photoactivated Localisation Microscopy (PALM), which uses Phototransformable Fluorescent Proteins (PTFPs) to image single molecules and localise them with 10-20 nm precision. PTFPs are proteins from the Green Fluorescent Protein (GFP) family, which not only produce fluorescence, but can also undergo light-induced reactions such as fluorescence activation or change in emission color. These specific properties are at the base of PALM, since they allow stochastic temporal separation of the fluorescence events and imaging of sparse single-molecules. The fact that PALM deals with single molecules prompted the development of a variety of applications, among which single-particle tracking PALM (sptPALM) and quantitative PALM (qPALM). These advanced applications already provide amazing insights into biological phenomena, but their use remains challenging. One of the reasons for this is the complex photophysical behaviour of PTFPs, beyond the transormations that are useful for PALM imaging.Therefore, this thesis focused on characterising the light-induced reactions occurring in Photoconvertible Fluorescent Proteins (PCFPs, some of the most popular PALM markers) with the aim of improving single-particle tracking and quantitative approaches in PALM. In particular, the work was directed to the understanding of transient losses of fluorescence, known as blinking, that are detrimental to PALM experiments. After a thorough characterisation of light-induced reactions in both the green and the red form of the investigated PCFPs, a strategy was proposed to alleviate blinking and the artefacts it produces. Finally, insights were given into the application of this strategy to improve a qPALM experiment.This work constitutes an further step towards a better understanding of PCFPs photophysics, and improved extraction of quantitative information from PALM datasets.


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