Computational study of the structure-function relationship of Kir3 channels and applications to the design of light-gated Kir3 channels

par Zlatomir Todorov

Thèse de doctorat en Biologie structurale et nanobiologie

Sous la direction de Michel Vivaudou.

Le président du jury était Cécile Breyton.

Le jury était composé de Michel Vivaudou, Lucie Delemotte, Jean-Baptiste Thibaud, Pierre Charnet, François Dehez.

Les rapporteurs étaient Lucie Delemotte, Jean-Baptiste Thibaud.

  • Titre traduit

    Etude computationnelle de la relation structure-fonction des canaux Kir3 et application dans la conception de canaux Kir3 sensibles à la lumière


  • Résumé

    Cette thèse de doctorat porte sur une famille de protéines transmembranaires exprimées sous forme de tétramères qui fonctionnent en tant que canaux ioniques sélectifs pour le potassium - le membre 3 des canaux potassiques à rectification entrante (Kir3). Quatre gènes codant pour les protéines Kir3 sont présents chez les mammifères dans la sous-famille, à savoir les membres Kir3.1-4. L'activité et l'expression tissulaire varient fortement en fonction des sous-unités constituant les canaux Kir3. Ces canaux sont activés par des interactions simultanées et directes avec des dimères bêta-gamma de la protéine G (Gβγ) libérés par les hétérotrimères de la protéine G de la classe G(i/o), des lipides PIP2 du feuillet interne de la membrane et des ions Na+ intracellulaires. Ces canaux permettent la genèse d’un courant potassique hyperpolarisant à des potentiels membranaires proches de l'EK. Ils jouent un rôle important dans la régulation de l'excitabilité cellulaire dans différents tissus. Des maladies ont été associées à une mauvaise régulation des canaux Kir3 de type sauvage ou à des mutations de leurs gènes.Un de mes objectifs a été de caractériser la dynamique conformationnelle sous-jacente à la fonction du canal Kir3.2 en utilisant la dynamique moléculaire. En partant de modèles obtenus par cristallographie aux rayons X, au lieu d’utiliser Gβγ pour ouvrir le canal dans nos simulations nous avons cherché à établir la stoichiométrie d’un ensemble de petites molécules connues pour l’activation de Kir3.2. Ainsi, dans une série de trajectoires où différentes combinaisons de partenaires étaient modélisées, le canal Kir3.2 a traversé différents états conformationnels et conducteurs – tout en reproduisant des caractéristiques décrites dans la littérature. Cette approche a amené à la découverte de nouveaux sites d'interaction lipide-protéine, potentiellement impliqués dans un mécanisme de rétroaction négative intrinsèque au canal Kir3.2. Cette prédiction est corroborée par des données de cristallographie aux rayons X publiées antérieurement et non exploitées dans ce contexte. L’analyse des trajectoires a également montré de nouvelles voies allostériques reliant les sites d’interaction du ligand aux portes du canal. De plus, sur la base de la dynamique du canal de type sauvage, nous avons proposé des mécanismes moléculaires pour plusieurs mutants pathologiques caractérisés expérimentalement.Parallèlement au projet théorique, j’ai travaillé à l’élaboration de canaux Kir3 sensibles à la lumière pour l’optogénétique. L’utilisation de modèles par homologie a guidé la sélection de résidus du canal qui ont été mutés en cystéine. La présence de cystéines réduites est nécessaire pour le marquage des protéines exprimées dans la membrane des ovocytes de Xenopus laevis avec les ligands photosensibles que nous avons utilisés. Parmi les vingt mutants cystéines criblées, l’un d’entre eux a montré un phénotype modéré de photo-activation. Ce phénotype a pu être considérablement amélioré par une mutation additionnelle, nous permettant d’obtenir le premier canal Kir3 constitutivement inactif et activable par la lumière.La procédure de simulation éprouvée dans ce travail est particulièrement adaptée à l’étude de divers canaux Kir3 d’intérêt. Une perspective pour nos modèles serait leur utilisation dans la conception de composés visant des conformations spécifiques du canal Kir3.2 en l’absence de données expérimentales sur les états d’ouverture et de fermeture complètes. Enfin, le canal Kir3.4 photosensible pourrait trouver des applications en biologie synthétique en tant que diode contrôlée par la lumière. En outre, ce mutant pourrait être inoculé in vivo – il devrait rester silencieux après marquage et fournir des informations sur le rôle physiologique de l'augmentation des courants médiés par canaux Kir3 lorsqu'il est activé par la lumière ultraviolette.


  • Résumé

    This doctoral thesis focuses on a family of transmembrane proteins expressed as tetrameric assemblies which function as selective potassium ion channels – the potassium inward rectifier member 3 (Kir3). In the sub-family, four genes coding Kir3 proteins are present in mammals, namely, members Kir3.1 4. The activity and tissue-specific expression of Kir3 channels greatly vary with subunit composition. Kir3 channels are activated by direct simultaneous interactions with G-protein beta-gamma dimers (Gβγ) released from G-protein heterotrimers of the G(i/o) class, PIP2 lipids from the inner membrane leaflet and intracellular Na+ ions. These channels mediate hyperpolarizing potassium currents at membrane potentials close to EK, thus they are critical for development and health as they play an important role in decreasing cell excitability in different tissues. Disease conditions have been linked to misregulation of wild-type Kir3 channels or mutations of their genes.Starting from an X-ray crystallographic model, our goal was to obtain trajectories demonstrating simulated molecular dynamics of the wild-type Kir3.2 channel. We optimized a computational protocol using a set of brute-force simulations where different combinations of Kir3 activators were implemented. We observed the Kir3.2 channel transitioning between different conformational and conductive states – successfully reproducing dynamic features reported in the literature. We discovered novel functional lipid-protein interaction sites potentially involved in a negative-auto-feedback mechanism intrinsic to the Kir3.2 channel. Interestingly, this prediction is backed by previously published X ray crystallography data not exploited in this scope. Detailed analysis of the trajectories provided description of novel allosteric pathways linking the channel gates and the ligand interaction sites. In addition, based on the observed dynamics of the wild-type channel, we proposed molecular mechanisms for several experimentally-characterized pathologic mutants.In parallel to the computational project, we attempted to engineer light-gated Kir3 channels. This work was aided by homology models which guided the selection of positions satisfying an arbitrary set of criteria for cysteine mutagenesis. The presence of reduced cysteines is required for the labeling of the proteins expressed into the membrane of Xenopus laevis oocytes with the photoswitchable tethered ligands (PTL) we used. Among the twenty screened cysteine mutants, one construct showed a mild photo-blocking phenotype. Further engineering greatly improved this phenotype, yielding the first light-activated Kir3.4 homotetrameric channel.We believe that our simulation procedure is particularly suited for the investigation of various Kir3 assemblies of interest. An additional perspective for our models is to be used for the rational design of compounds targeting a specific conformation of Kir3.2 channel in the absence of experimentally obtained fully open/closed and transition-states conformations. Lastly, the developed photo-blocked Kir3.4 homotetramer could find applications in synthetic biology as a light-enabled diode. Alternatively, this mutant could be knocked-in in vivo – it should remain silent upon PTL-labeling in the resting-state, and provide information on the physiological role of the increase of Kir3 mediated currents when activated by ultra-violet light.


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