Amplification de la fluorescence par diffusion multiple : une étude exploratoire vers des conditions biocompatibles

par Sylvain Bonnefond

Thèse de doctorat en Physique

Sous la direction de Gian Luca Lippi et de Frédéric Brau.

Soutenue le 03-12-2019

à l'Université Côte d'Azur (ComUE) , dans le cadre de École doctorale Sciences fondamentales et appliquées (Nice) , en partenariat avec Université de Nice (1965-2019) (établissement de préparation) , Institut de Physique de Nice (laboratoire) et de Institut de Physique de Nice (laboratoire) .

Le président du jury était Ellen Van Obberghen-Schilling.

Le jury était composé de Ellen Van Obberghen-Schilling, Antoine Delon, Martin Oheim, Nathalie Westbrook.

Les rapporteurs étaient Antoine Delon, Martin Oheim.


  • Résumé

    L’objet de cette thèse a consisté à mettre au point une méthode d’amplification de la fluorescence en utilisant la diffusion multiple (introduction de nanoparticules diélectriques, élastiques et passives) qui sera applicable sur des échantillons biologiques. Cela a nécessité de faire le lien entre le concept de laser biologique et de laser aléatoire pour une utilisation dans un régime amplifié, qui précède le régime laser, applicable aux marquages cellulaires et tissulaires. La génération d’une amplification passe par l’utilisation de diffuseurs (nanoparticules de dioxyde de titane dans ce travail) répartis de façon homogène. Il a fallu mettre au point des conditions de stabilisation colloïdale par adsorption de protéine (BSA) pour éviter l’agrégation des nanoparticules en tampons et milieux biologiques. Un montage optique a été mis au point pour exciter les fluorophores de façon reproductible, en évaluant précisément l’énergie de pompe et la réponse impulsionnelle de fluorescence, tout en optimisant la fenêtre d’observation pour limiter le photoblanchiment des fluorophores et la phototoxicité des cellules. Une première amplification stimulée a été montrée et validée avec une dispersion colloïdale dans une solution aqueuse homogène de FITC à une concentration de 200 µM. Cette expérience a prouvé qu’il est possible d’atteindre un gain de fluorescence jusqu’à 40 associé à une diminution de la largeur spectrale jusqu’à 5 nm, et une réduction globale de la durée de vie. La présence du processus d’émission stimulée dans l’amplification est confirmée par la corrélation entre la fluorescence et la concentration des nanoparticules ou l’énergie de pompe. Cette première démarche a été étendue à des concentrations de 2 et 20 µM pour lesquelles une saturation rapide du gain (respectivement ~ 10 et 20) a été constatée. Enfin une amplification a été montrée et validée sur des cellules en suspension marquées par la CFSE ou exprimant la GFP dans leur milieu de culture. Dans ces conditions une diminution du gain par rapport aux conditions précédentes a été constatée (jusqu’à 6 – 10 fois). L’explication de ce gain moindre a été explorée en testant les modifications des milieux sur l’amplification, et la présence d’une couche de BSA entourant les nanoparticules semble en être la cause car elle diminue probablement l’indice de réfraction effectif de la nanoparticule conduisant à une faible diffusion.

  • Titre traduit

    Fluorescence amplification by multiple scattering : an exploratory study towards biocompatible conditions


  • Résumé

    The purpose of this PhD has been to develop a method of amplification of the fluorescence by using the multiple scattering (introduction of dielectric, elastic and passive nanoparticles) that will be applicable to biological samples. This required doing the link between the biological laser and random laser concept for a use in an amplified regime, which precedes the laser regime, applicable to cell and tissue labelling. The generation of an amplification passes by the use of scatterers (nanoparticles of titanium dioxide in this work) homogeneously distributed. It required developing conditions of the colloidal stabilization to avoid the aggregation of nanoparticles into biological media and buffers by the adsorption of proteins (BSA). An optical setup has been developed to excite the fluorescence, by accurately evaluating the pump energy and the pulse response of fluorescence, while optimizing the observation window to limit photobleaching of fluorophores and cell toxicity. A first stimulated amplification was shown and validated with a colloidal suspension in a homogeneous aqueous solution of FITC at a concentration of 200 µM. This experiment has shown that it is possible to achieve a fluorescence gain up to 40 associated with a decrease in spectral width up to 5 nm, and an overall reduction in lifetime. The presence of the stimulated emission process in amplification is confirmed by the correlation between fluorescence and nanoparticle concentration or pump energy. This first step was extended to concentrations of 2 and 20 µM for which a rapid saturation of the gain (respectively ~ 10 and 20) was observed. Finally, amplification has been shown and validated on CFSE-labeled or GFP-expressing suspension cells in their culture medium. In these conditions, a decreasing of the gain compared with the previous conditions has been observed (up to 6 – 10 times). The explanation of this lower gain has been explored by testing the changes of media on amplification, and the presence of a layer of BSA surrounding the nanoparticles seems to be the cause because the protein decreases probably the refractive index of the nanoparticle leading a weak scattering.


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