Contribution des phytoglobines et des nitrate réductases à la régulation de l’oxyde nitrique et de la fixation de l’azote dans la symbiose Medicago truncatula / Sinorhizobium meliloti

par Antoine Berger

Thèse de doctorat en Interactions moléculaires et cellulaires

Sous la direction de Renaud Brouquisse.

Soutenue le 12-03-2019

à Côte d'Azur , dans le cadre de École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Sophia Antipolis, Alpes-Maritimes) , en partenariat avec Université de Nice (1965-2019) (établissement de préparation) , Institut Sophia Agrobiotech (Sophia Antipolis, Alpes-Maritimes) (laboratoire) et de Institut Sophia Agrobiotech [Sophia Antipolis] (laboratoire) .

Le président du jury était David Wendehenne.

Le jury était composé de David Wendehenne, María Romero-Puertas, Marc Lepetit, Eliane Meilhoc, Alexandre Boscari.

Les rapporteurs étaient María Romero-Puertas, Marc Lepetit.


  • Résumé

    La symbiose fixatrice d’azote entre les légumineuses et les bactéries du sol de type Rhizobium permet de réduire l’azote atmosphérique (N2) en ammoniaque (NH3) grâce à la présence de la nitrogénase bactérienne au sein d’un organe racinaire appelé nodosité. Dans le modèle symbiotique Medicago truncatula/Sinorhizobium meliloti, l’oxyde nitrique (NO) est produit tout au long du processus symbiotique, du début de l’interaction entre la plante et les bactéries jusqu’à la sénescence de la nodosité. Les effets toxiques, de signal ou de métabolite du NO dépendent principalement de sa concentration à son site d’action. Sa concentration au sein des cellules des nodosités doit être régulée afin de limiter ses effets toxiques et lui permettre de remplir ses fonctions de signalisation et de métabolite. Chez les plantes, les principales sources de NO identifiées sont la nitrate réductase (NR) et la chaîne de transfert d’électrons mitochondriale (ETC). Par ailleurs, les phytoglobines (Phytogb) sont connues pour être impliquées dans le catabolisme du NO. D’après leur homologie de séquence et leur affinité pour l’oxygène, trois classes de Phytogb ont été décrites chez les légumineuses : les Phytogb non-symbiotiques (Phytogb1), les leghémoglobines (Lb) -spécifiques des légumineuses- et les Phytogb tronquées (Phytogb3).Les principaux objectifs de cette thèse ont été, d’une part, de caractériser et étudier le rôle des NR et des Phytogb dans la régulation du NO lors de la symbiose entre M. truncatula et S. meliloti et, d’autre part, d’analyser le rôle du NO dans le développement et le fonctionnement du processus symbiotique.Chez M. truncatula, 3 gènes codent pour des NR et 17 pour des Phytogb. L’étude phylogénétique des séquences de Phytogb de M. truncatula a permis d’identifier 12 Lb, 3 Phtyogb1 et 2 Phytogb3. L’analyse de l’expression des gènes de NR et de Phytogb, ainsi que la mesure de l’activité totale des NR et la production du NO a permis de suivre le niveau de NO durant la symbiose fixatrice d’azote, ainsi que le rôle respectif des différentes NR et Phytogb dans sa régulation. Au cours du processus symbiotique, quatre pics de production de NO ont été observés, correspondant à quatre étapes du processus symbiotique, pendant (1) l’établissement de l’interaction la plante et la bactérie, (2) le début de l’organogénèse de la nodosité, (3) le fonctionnement de la nodosité mature et (4) lors de l’entrée en sénescence des nodosités. Lors de ces différentes étapes, la production de NO a pu être particulièrement corrélée à l’expression des gènes des NR1 et NR2, d’une Phytogb1 (Phytogb1.1) et d’une Phytogb3 (Phytogb3.1). L’utilisation de divers inhibiteurs des voies de synthèse du NO a montré que la production de NO dépend principalement de l’activité NR et de la chaîne de transfert d’électrons mitochondriale. L’utilisation de donneurs de NO a permis de montrer que, lors du développement nodulaire, le NO induit l’expression des Phytogb1 et de plusieurs gènes de défense, mais réprime celle des Lb et Phytogb3. Une analyse fonctionnelle de Phytogb1.1 pendant l’établissement, le fonctionnement et la sénescence de la nodosité, a été initiée via la production de plants de M. truncatula sur-exprimant ou sous-exprimant ce gène. La surexpression et la sous-expression de ce gène ont abouti respectivement à une diminution et une augmentation du niveau de NO dans les nodosités, mais s’est traduit dans les deux cas par une diminution du nombre de nodosités par plante. L’analyse de l’expression d’un certain nombre de gènes marqueurs de l’interaction symbiotique, des réponses de défense, du métabolisme azoté et de l’hypoxie, et les mesures de fixation de l’azote dans les nodosités matures ont mis en évidence le rôle particulier de Phytogb1.1 dans la régulation du NO au cours du développement nodulaire et lors de l’entrée en sénescence des nodosités.

  • Titre traduit

    Contribution of phytoglobins and nitrate reductases to the nitric oxide regulation and nitrogen fixation in Medicago truncatula / Sinorhizobium meliloti symbiosis


  • Résumé

    The nitrogen-fixing symbiosis between legumes and soil bacteria of Rhizobia type reduces atmospheric nitrogen (N2) to ammonia (NH3) through the presence of bacterial nitrogenase in a root organ, called nodule.In the symbiotic model Medicago truncatula / Sinorhizobium meliloti, nitric oxide (NO) is produced throughout the symbiotic process, from the beginning of the interaction between the plant and the bacteria until the senescence of the nodule. The toxic, signal or metabolite effects of NO depend mainly on its concentration at the action site. Its concentration within the nodule cells must be regulated in order to limit its toxic effects and leads its signaling and metabolite functions. In plants, the main sources of NO identified are nitrate reductase (NR) and the mitochondrial electron transfer chain (ETC). In addition, phytoglobins (Phytogb) are known to be involved in the catabolism of NO. According to their sequences homology and affinity for oxygen, three classes of Phytogb have been described in legumes: non-symbiotic Phytogb (Phytogb1), legume-specific leghemoglobin (Lb) and truncated Phytogb (Pgb3).The main objectives of this PhD were, on the one hand, to characterize and study the role of NR and Phytogb in the NO regulation, during the symbiosis between M. truncatula and S. meliloti and, on the other hand, to analyse the role of NO in the development and in mature nodule during the symbiotic process.In M. truncatula, 3 genes code for NR and 17 for Phytogb. The phylogenetic study of M. truncatula Phytogb identified 12 Lb, 3 Phytogb1 and 2 Phytogb3. Analysis of NR and Phytogb gene expression, as well as measurement of total NR activity and NO production, allowed to monitor the level of NO during the N2-finxing symbiosis, and to determine the respective roles of the different NR and Phytogb in the NO regulation. During the symbiotic process, four peaks of NO production were observed, corresponding to four periods of the symbiotic process, during (1) the establishment of the interaction between the plant and the bacteria, (2) at the setup of the nodule organogenesis (3) inside the functioning and mature nodule and (4) at the onset of nodule senescence. During these different periods, the production of NO is particularly correlated with the expression of the NR1 and 2, one Phytogb1 (Phytogb1.1) and one Phytogb3 (Phytogb3.1) genes. The use of various inhibitors of NO synthesis pathways has shown that NO production depends mainly on NR activity and the mitochondrial electron transfer chain. The use of NO donors has shown that, during nodular development, NO induces the expression of Phytogb1 and several defence genes but represses Lb and Phytogb3 genes. Functional analysis of Phytogb1.1, during nodule establishment, functioning and senescence, was initiated via the production of M. truncatula plants overexpressing or silencing this gene. Overexpression and under-expression of this gene resulted, respectively, in a decrease and an increase in the NO level in the nodules, but in both cases resulted in a decrease in the number of nodules per plant. Analysis of the expression of several markers genes of the symbiotic interaction, defence responses, nitrogen metabolism and hypoxia, and analysis of nitrogen fixation in mature nodules highlight the particular role of Phytogb1.1 in the NO regulation during nodule development and during the senescence process.


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