Impact of mechanical and oxidative stress on red blood cell properties in sickle cell disease

par Maria Lizarralde Iragorri

Thèse de doctorat en Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie. Génétique

Sous la direction de Wassim El Nemer.

Soutenue le 27-09-2018

à Sorbonne Paris Cité , dans le cadre de École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....) , en partenariat avec Biologie intégrée du globule rouge (Paris) (laboratoire) et de Université Paris Diderot - Paris 7 (1970-2019) (établissement de préparation) .

Le président du jury était Fernando Rodrigues-Lima.

Le jury était composé de Véronique Baudin-Creuza.

Les rapporteurs étaient Catherine Badens, Vincent Pialoux.

  • Titre traduit

    [Impact du stress mécanique et oxydatif sur les propriétés des globules rouges dans la drépanocytose]


  • Résumé

    Le globule rouge est une cellule simple avec l’une des fonctions les plus importantes de l’organisme : participer aux échanges gazeux et fournir l’oxygène aux tissus. C'est un disque biconcave hautement élastique grâce à un réseau de protéines du cytosquelette et de protéines membranaires spécifiques. La fonction, ainsi que la structure des globules rouges sont altérées dans plusieurs pathologies humaines telles que les hémoglobinopathies et les anomalies de membrane. La drépanocytose est une maladie héréditaire génétique caractérisée par une hémoglobine anormale qui polymérise en conditions hypoxiques provoquant la déformation des globules rouges circulants. La drépanocytose se caractérise également par une anémie hémolytique chronique et des crises vaso-occlusives douloureuses dues à l'obstruction des capillaires.Dans le but de mieux comprendre les mécanismes responsables des manifestations cliniques, nous avons étudié les propriétés mécaniques et adhésives des globules rouges de patients atteints de drépanocytose en évaluant 1) l'impact de contraintes mécaniques répétées sur la survie des globules rouges à l'aide d'un appareil microfluidique qui mime la microcirculation et 2) le rôle du stress oxydant dans l'activation des protéines d'adhérence érythroïde.Nous avons conçu une puce microfluidique et montré que le stress mécanique est un paramètre critique sous-jacent à l'hémolyse intravasculaire dans la drépanocytose et que des taux intracellulaires élevés d'hémoglobine fœtale préviennent cette lyse. Outre ces résultats, nous avons constaté que le traitement à l'hydroxyurée protège les globules rouges de la lyse lors d'un stress mécanique, même en l'absence d'expression de l'hémoglobine fœtale. D'autre part, nous avons étudié la structure et la fonction de la protéine d'adhérence érythroïde Lu/BCAM dans des conditions oxydantes en utilisant des approches biochimiques et d'imagerie. Nous avons observé que le stress oxydant active la fonction adhésive de Lu/BCAM par des modifications post-traductionnelles qui modifient sa distribution membranaire. Nous décrivons un nouveau mécanisme qui affecte les interactions en cis de Lu/BCAM à la surface cellulaire et qui pourraient expliquer l'adhérence anormale des globules rouges à la laminine en l'absence d'événements de phosphorylation.En conclusion, nous avons développé un modèle microfluidique reproduisant les dimensions physiologiques des microvaisseaux humains, permettant d’évaluer les caractéristiques cellulaires jusque-là inexplorées dans la drépanocytose. Nous montrons que le stress mécanique répété est en partie responsable de l'hémolyse chez les patients atteints d'anémie falciforme, ce qui pourrait contribuer aux niveaux élevés de stress oxydant en raison de l'hème libre dans la circulation. Nos travaux démontrent l'importance de la dimension mécanique dans l’obstruction des capillaires et la contribution critique du stress oxydant dans l'adhérence anormale des globules rouges dans cette maladie. Améliorer la déformabilité des globules rouges et cibler le stress oxydant pour inhiber l'adhérence des globules rouges serait une stratégie prometteuse pour cibler les principales caractéristiques de cette pathologie et alléger le fardeau de la maladie.


  • Résumé

    The red blood cell is a simple cell with one of the most important functions in the organism, that is fulfilling the gas exchange function and delivering oxygen to the tissues. It is a highly elastic biconcave disk thanks to a network of specific skeletal and membrane proteins. The function and structure of the red cell are altered in several human pathologies like hemoglobinopathies and membrane disorders. Sickle cell disease is a genetic hereditary disorder characterized by abnormal hemoglobin that polymerizes under hypoxic conditions leading to the sickling and alteration of circulating red cells. The hallmarks of sickle cell disease are hemolytic anemia and painful vaso-occlusive crises due to the obstruction of fine capillaries.With the aim of better understanding the mechanisms behind these clinical manifestations we investigated the mechanical and adhesive properties of red blood cells from patients with sickle cell disease by assessing 1) the impact of repeated mechanical stress on red cell survival using a microfluidic device that mimic human microcirculation, and 2) the role of oxidative stress in the activation of erythroid adhesion proteins.We designed a microfluidic device that allowed us to show that mechanical stress is a critical parameter underlying intravascular hemolysis in sickle cell disease and that high intracellular levels of fetal hemoglobin protect against lysis. Furthermore, we found that treatment with hydroxyurea protects red blood cells from lysis upon mechanical stress even in the absence of fetal hemoglobin expression. On the other hand, we investigated the structure and function of the erythroid adhesion protein Lu/BCAM under oxidative conditions using biochemical and imaging approaches. We observed that oxidative stress activates the adhesive function of Lu/BCAM through post-translational modifications that alter its membrane distribution. We describe a novel mechanism that affects Lu/BCAM cis-interactions at the cell surface that might account for the abnormal adhesion of sickle red cells to laminin in the absence of phosphorylation events.In conclusion, we developed a microfluidic device replicating the physiological dimensions of human microvessels that allows assessing previously unexplored cellular characteristics in sickle cell disease. We show that repeated mechanical stress is partly responsible for hemolysis in patients with sickle cell disease, which might contribute to the high levels of oxidative stress because of free heme in the circulation. Our work demonstrates the importance of the mechanical dimension in the blockade of small capillaries and the critical contribution of oxidative stress in the abnormal adhesion of red cells in this disease. Improving red cell deformability and targeting oxidative stress to inhibit red cell adhesion would be promising strategies to target the main hallmarks of this pathology and alleviate the disease burden.

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