Caractéristiques de l'activation des monocytes humains par le lipide A monophosphorylé

par Ryme Chentouh

Thèse de doctorat en Immunologie

Sous la direction de Jean-Marc Cavaillon.

Soutenue le 20-11-2018

à Sorbonne Paris Cité , dans le cadre de École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris) , en partenariat avec Université Paris Descartes (1970-2019) (établissement de préparation) .

Le président du jury était Chantal Desdouets.

Le jury était composé de Jean-Marc Cavaillon, Chantal Desdouets, Sylvie Chollet-Martin, Pierre Moine, Lhousseine Touqui.

Les rapporteurs étaient Sylvie Chollet-Martin, Pierre Moine.


  • Résumé

    Le lipopolysaccharide (LPS), un agoniste du Toll-like récepteur 4 (TLR4) est un puissant immunomodulateur dont l’utilisation est limitée en pratique clinique par sa toxicité. Le monophosphoryl lipide A (MPLA) est un dérivé non toxique du LPS commercialisé comme adjuvant vaccinal et d’intérêt majeur dans de nombreux domaines. Les mécanismes sous-jacents aux propriétés non-toxiques et immunomodulatrices du MPLA sont mal caractérisés chez l’homme. Un modèle in vitro de monocytes humains de donneurs sains nous a permis de définir les caractéristiques spécifiques de l’activation par le MPLA. Le MPLA induit une production moindre de cytokines proinflammatoires (interleukin-1ß-IL-1ß et tumor necrosis factor-TNF) que les LPS. La production de cytokines anti-inflammatoires telles que l’IL-10 (interleukin-10) et l’IL-1Ra (IL-1 receptor antagonist) n’est pas significativement différente. Pour un même donneur, les productions respectives d’IL-1ß et TNF après stimulation par LPS ou MPLA ne sont pas corrélées, cela suggère une activation de voies de signalisation différentes par chaque agoniste. L’utilisation d’inhibiteurs du TLR4 (LPS Rhodobacter spheroides et Eritoran) a démontré que le MPLA et les LPS sont dépendant du TLR4. En revanche, contrairement au LPS, le MPLA ne nécessite pas le corécepteur CD14 pour induire une production de cytokines. L’utilisation d’inhibiteurs de polymérisation de l’actine (cytochalasine D et latrunculine A) a démontré la dépendance du MPLA aux mécanismes d’endocytose actine-dépendants pour la production de cytokines. Après stimulation par le LPS, une dépendance partielle à l’endocytose actine-dépendante est observée pour la production d’IL-1ß et de TNF dans la sous-catégorie des donneurs forts producteurs. Cela suggère que les voies de signalisation engagées par le MPLA sont intracellulaires et qu’elles sont également activées dans la sous-catégorie des donneurs forts producteurs après exposition au LPS. La voie de signalisation endosomale du TLR4 est la voie TRIF-dépendante. Cette voie de signalisation est partagée par le TLR3. Contrairement à ce qui a été publié sur modèle murin, il n’a pas pu être montré que la signalisation du MPLA dans les monocytes humains est préférentiellement conduite via la voie TRIF-dépendante. En effet, contrairement au Poly I :C, un agoniste du TLR3, le MPLA et les LPS n’induisent pas de CXCL-10 après stimulation. Le fait que la production de CXCL-10 après stimulation par poly I :C soit totalement inhibée par la cytochalasine D suggère cependant des mécanismes communs d’endocytose. La signalisation SYK-dépendante en aval de TLR4 a été impliquée à la fois dans l’endocytose de TLR4 CD14-dépendante mais aussi dans les productions de haut niveau de cytokines proinflammatoires. L’utilisation d’un inhibiteur de la phosphorylation de SYK, R406, n’a révélé aucune différence entre le MPLA et les LPS. Contrairement au modèle murin, les monocytes produisent de l’IL-1ß après une stimulation unique par un agoniste du TLR4, démontrant une capacité d’activation en un temps de l’inflammasome. Une corrélation significative entre la production d’IL-1ß et de TNF est observée après stimulation par MPLA. Cette corrélation n’est pas retrouvée après stimulation par LPS. Ainsi l’activation de l’inflammasome pourrait jouer un rôle-clé dans la signalisation induite par le MPLA. Ceci est conforté par l’utilisation d’un inhibiteur de pan-caspase (Z-VAD) dont l’effet inhibiteur sur la production de TNF est significativement plus élevé pour le MPLA que pour les LPS. En conclusion, la non-toxicité du MPLA se traduit dans les monocytes humains par une production moindre d’IL-1ß et de TNF en rapport avec une signalisation différente de celle engagée par les LPS. Le MPLA nécessite une endocytose du TLR4 actine-dépendante et CD14-indépendante. Le TLR4 pourrait soit engager une signalisation intracellulaire soit être un transporteur pour le MPLA qui activerait lors directement l’inflammasome.

  • Titre traduit

    Characteristics of human monocytes activation by monophosphoryl lipid A


  • Résumé

    Lipopolysaccharide (LPS), a Toll-like receptor 4 (TLR4) agonist is a potent immunomodulator whose use is limited in clinical practice by its toxicity. Monophosphoryl lipid A (MPLA) is a nontoxic derivative of LPS marketed as a vaccine adjuvant and of major interest in many fields. The mechanisms underlying the non-toxicity and immunomodulatory properties of MPLA are poorly characterized in humans. An in vitro model of human monocytes from healthy donors allowed us to define specific characteristics of MPLA activation. MPLA induces a lower production of proinflammatory cytokines (interleukin-1ß-IL-1ß et tumor necrosis factor-TNF) than LPS. The production of anti-inflammatory cytokines such as IL-10 (interleukin-10) and IL-1Ra (IL-1 receptor antagonist) are not significantly different. For a same donor, the respective productions of IL-1ß and TNF after stimulation by LPS or MPLA are not correlated, suggesting an activation of different signaling pathways by each agonist. The use of TLR4 inhibitors (LPS Rhodobacter spheroides and Eritoran) has demonstrated that MPLA and LPS are TLR4 dependent. In contrast, unlike LPS, MPLA does not require the CD14 co-receptor to induce cytokine production. The use of actin polymerization inhibitors (cytochalasin D and latrunculin A) has demonstrated the dependence of MPLA on actin-dependent endocytosis mechanisms for cytokine production. Following LPS stimulation, partial dependence on actin-dependent endocytosis is observed for IL-1ß and TNF production in the high-producers donor subset. This suggests that the signaling pathways initiated by MPLA are intracellular and are also activated in the high-producers donor subset after exposure to LPS. The endosomal signaling pathway of TLR4 is the TRIF-dependent pathway. This signaling pathway is shared by the TLR3. Contrary to what has been published on a mouse model, it has not been possible to show that MPLA signaling is human monocytes is preferentially carried out via the TRIF-dependent pathway. Indeed, unlike poly I:C, a TLR3 agonist, MPLA and LPS do not induce CXCL-10 after stimulation. The fact that the production of CXCL-10 is totally inhibited by cytochalasin D, however, suggests shared mechanisms of endocytosis. SYK-dependent signaling downstream of TLR4 has been implicated in both CD14-dependant TLR4 endocytosis and in high-level productions of proinflammatory cytokines. The use of a SYK phosphorylation inhibitor, R406, revealed no difference between MPLA and LPS. In contrast to the murine model, monocytes produce IL-1ß after a single TLR4 agonist stimulation, demonstrating a one-step inflammasome activation ability. A significant correlation between IL-1ß and TNF production is observed following MPLA exposure. This correlation is not found following LPS exposure. Thus, inflammasome activation could play a key role in MPLA-induced signaling. This is supported by the use of a pan-caspase inhibitor, (Z-VAD) whose inhibitory effect on TNF production is significantly greater for MPLA than for LPS. In conclusion, the non-toxicity of MPLA is reflected in human monocytes by a lower production of IL-1ß and TNF in relation to a signaling different from that initiated by LPS. MPLA requires actin-dependent and CD14-independant TLR4 endocytosis. TLR4 could either initiate intracellular signaling or be a cargo for MPLA which would then directly activate the inflammasome.


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