Rôle des facteurs d’hypervirulence dans la traversée de la barrière foeto-placentaire par Listeria monocytogenes

par Charlotte Gaultier

Thèse de doctorat en Microbiologie

Sous la direction de Marc Lecuit.

Soutenue le 19-11-2018

à Sorbonne Paris Cité , dans le cadre de École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....) , en partenariat avec Université Paris Descartes (1970-2019) (établissement de préparation) .

Le président du jury était Olivier Dussurget.

Le jury était composé de Marc Lecuit, Olivier Dussurget, Hélène Bierne, Elisabeth Menu, Javier Pizarro-Cerdà, Didier Lereclus.

Les rapporteurs étaient Hélène Bierne, Elisabeth Menu.


  • Résumé

    Listeria monocytogenes (Lm) est une bactérie Gram positive ubiquitaire et pathogène responsable de la listériose, dont la forme materno-fœtale est particulièrement sévère pour le fœtus. Après ingestion d'aliments contaminés, Lm traverse la barrière intestinale et dissémine dans l'organisme. Elle peut traverser la barrière placentaire par l'action conjuguée de deux protéines de surface, InlA et InlB, qui interagissent avec leurs récepteurs respectifs E-cad et Met et induisent l'internalisation de Lm dans le syncytiotrophoblaste. De plus, la population de Lm est hétérogène et divisée en complexes clonaux (CC), dont certains sont associés épidémiologiquement à des cas cliniques. Notamment, CC4 est associé aux infections materno-fœtales. Dans un modèle de souris gestantes permissives à l'infection par Lm, CC4 est en effet hypervirulent par rapport à la souche de référence EGDe. L'objectif de cette thèse étaient donc de comprendre les mécanismes responsables de l'hypervirulence materno-fœtale de CC4. Nous avons pu montré par des études de cinétique de l’infection placentaire et de clonalité que les étapes précoces de l'infection placentaire, c'est-à-dire la traversée de la barrière placentaire per se, étaient déterminantes dans l'hypervirulence de CC4. De manière intéressante, CC4 et EGDe sont transmis aussi efficacement au fœtus, et sont aussi virulents dans les organes maternels après infection intraveineuse. La traversée de la barrière étant dépendante d'InlA et d'InlB, nous avons étudié les fonctions de ces derniers dans CC4. Nous avons montré que CC4 est plus adhérent et invasif qu'EGDe dans un modèle de lignée cellulaire trophoblastique et que cette capacité est principalement dépendante d'InlA. En accord avec ceci, l'opéron inlAB est surrégulé dans CC4. Il a été montré également au laboratoire que PTS est un facteur de virulence spécifique de CC4 impliqué dans l'infection fœto-placentaire. Nous n'avons cependant pas pu relier ce facteur à la capacité d'invasion de CC4. L'opéron inlAB est régulé par deux principaux régulateurs : PrfA, le régulateur majeur de la virulence chez Lm, et sigB, un facteur alternatif de transcription central dans la réponse au stress. Nous avons étudié les niveaux d'activation de ces deux régulateurs dans CC4 et EGDe. Pour cela, nous avons adapté un système rapporteur de l'activité de sigB, qui consiste à insérer dans le génome une protéine fluorescente sous le contrôle de Plmo2230, directement régulé par sigB. Grâce à l'analyse par cytométrie en flux de ces bactéries dans différents environnements, nous avons pu montré que CC4 exprime un niveau basal de sigB plus important qu'EGDe. Ainsi, in vivo, et plus particulièrement dans les placentas, l'activité de sigB de CC4 est plus forte. Inversement en conditions activatrices de sigB, nous ne détectons plus de différence entre les deux souches. Des données préliminaires suggèrent en revanche que l'activité de PrfA est semblable entre les deux souches. Ce régulateur ne semble donc pas clé dans l'hypervirulence. Nous avons donc émis l'hypothèse que l'hypervirulence materno-fœtale de CC4 reposait sur une plus grande activité basale de sigB suffisante à rendre cette souche plus invasive. Nous souhaitons désormais découvrir les facteurs impliqués dans la régulation de sigB et notamment son retour à l'état basal.

  • Titre traduit

    Understanding the role of Listeria monocytogenes factors durong fetal-placental barrier crossing


  • Résumé

    Listeria monocytogenes (Lm) is a Gram positive ubiquitous pathogen responsible for maternal-fetal listeriosis, a disease with severe fetal outcomes. After ingestion of contaminated fodd, Lm can cross the intestinal barrier and disseminate in the organism through the systemic circulation. It can cross the placental barrier through the conjugated actions of two surface proteins, InlA and InlB, interacting with their respective receptor E-cad and c-Met. These interactions induce the internalization of Lm in the syncytiotrophoblast at the surface of placental villi. Moreover, Lm population is heterogeneous and divided into clonal complexes (CC) according to their MLST profiles. Some of them are epidemiologically associated to clinical cases. Among them, CC4 is associated to maternal-fetal cases. CC4 is hypervirulent in a permissive pregnant mouse model compared to the lab reference strain EGDe. The aim of this work is to decipher the mechanisms responsible for MF hypervirulence of CC4. We could demonstrate with placental infection kinetics and clonality studies, that early steps of placental infection, meaning the crossing of the barrier per se, is crucial to hypervirulence. Interestingly, CC4 and EGDe display the same behaviours in maternal organs after IV infection and are transmitted with the same efficiency to the fetus. The crossing of the placental barrier is dependant on InlA and InlB. We showed that CC4 adheres more and invades more trophoblastic cell lines and that this capacity is due to a higher amount of functional InlA. Accordingly to this the inlAB operon is upregulated in CC4. Is has also been previously shown in the lab that PTS is a CC4-specific factor involved in placental infection. We couldn't however link this factor to the phenotype of invasion. The inlAB operon is regulated by two main factors, PrfA, the master commander of virulence in Lm, and sigB, an alternative sigma factor with a central role in the response to different stress. We studied the level of activation of both regulators in CC4 and EGDe. To this aim we adapted a reporter system of the sigB activity consisting in a fluorescent protein under the control of the sigB regulated promoter Plmo2230. By flow cytometry analysis of those strains in different environments, we could show that the basal level of sigB is higher in CC4 than in EGDe. More importantly, it seems to be the case in vivo in the placentas. However in activating conditions, we could not detect any difference between those strains. Preliminary data suggest that the activity of PrfA is similar. We drew the hypothesis that the hypervirulence of CC4 during the placental barrier crossing is due to a higher basal activity of sigB, sufficient to render this strain more invasive. Supplementary studies on the mechanisms behind sigB regulation are now needed.

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