Caractérisation fonctionnelle de la protéine ANKS3 impliquée dans les ciliopathies rénales et étude de son rôle dans la régulation des ARNs

par Gweltas Odye

Thèse de doctorat en Biologie cellulaire

Sous la direction de Sophie Saunier.

Soutenue le 02-07-2018

à Sorbonne Paris Cité , dans le cadre de École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris) , en partenariat avec Université Paris Descartes (1970-2019) (établissement de préparation) et de Imagine - Institut des maladies génétiques / IMAGINE - U1163 (laboratoire) .

Le président du jury était Jeanne Amiel.

Le jury était composé de Sophie Saunier, Jeanne Amiel, Brigitte Lelongt, Bénédicte Durand, Philippe Bastin, Hervé Le Hir.

Les rapporteurs étaient Brigitte Lelongt, Bénédicte Durand.


  • Résumé

    La Néphronophtise (NPH) est une néphropathie tubulo-interstitielle autosomique récessive, caractérisée par la présence d'une fibrose interstitielle massive et la formation de kystes. Elle est la cause majeure d'insuffisance rénale terminale chez l'enfant ou le jeune adulte. Elle peut être isolée ou syndromique, associée à des atteintes extrarénales. La NPH appartient aux ciliopathies, un ensemble de maladies multisystémiques causées par des mutations dans des gènes codant pour des protéines du cil primaire. Le cil primaire agit, à la surface de la plupart des cellules, comme un mécano et chimiosenseur contrôlant des voies de signalisation essentielles au développement et à l'homéostasie tissulaire (Shh, Wnt, signalisation PC2/Ca2). Vingt-trois gènes responsables de la NPH ont été identifiés (dont 14 dans notre laboratoire). Ils codent pour des protéines assurant des fonctions ciliaires telles que le contrôle de la composition protéique et de la signalisation ciliaire, à la base du cil (zone de transition (TZ)), au niveau du compartiment Inversine (CI), ou lors du transport intraflagellaire. Nous avons identifié une mutation faux-sens homozygote dans un nouveau gène, responsable d'une NPH associée à une fibrose hépatique. ANKS3 code une protéine connue pour interagir avec plusieurs protéines NPHP de la TZ (NPHP1), du CI (ANKS6, NEK8) ainsi qu'avec BICC1, une ribonucléoprotéine mutée dans les dysplasies rénales kystiques. Mon projet de thèse a porté sur la caractérisation de la fonction d'ANKS3 et de l'impact de la mutation humaine dans les processus cellulaires altérés dans les ciliopathies rénales. Ces études ont été réalisées à partir de différents modèles cellulaires: fibroblastes de patients, cellules tubulaires rénales IMCD3 déplétés pour Anks3 (ANKS3_KD) ré-exprimant la forme sauvage ou mutée. Mes travaux ont ainsi montré que la mutation ANSK3 diminue son interaction avec les composants de la TZ, NPHP1 et du CI, NEK8. Par ailleurs, l'absence ou l'expression de la forme mutée de ANKS3 perturbe la taille des cils et la biogenèse du CI. En effet, les composants du CI sont anormalement relocalisés le long du cil. Par ailleurs, une perturbation de la signalisation ciliaire de la voie Shh et de la localisation de la protéine PC2 au cil ont été observée dans les cellules ANKS3_KD ou mutantes. Cette dernière observation est confirmée dans le modèle du poisson zèbre muté pour anks3 (TALEN), qui présente une diminution de la motilité ciliaire associée à des altérations de la voie calcique dans la vésicule de Kupffer, conduisant à des défauts de latéralité (situs inversus). Outre ces défauts ciliaires, la perte ou la mutation de ANKS3 entrainent des défauts de polarité apico-basale dans les cellules IMCD, avec une diminution de la hauteur des cellules et un retard de la formation des jonctions serrées, un phénotype déjà observé dans les modèles mutés pour NPHP1. De façon concordante avec ces résultats nous avons observé une diminution de la stabilité des transcrits Nphp1 dans les cellules ANKS3_KD et mutantes. La réexpression de NPHP1 dans ces cellules restaure les défauts de polarité et de longueur des cils démontrant l'implication de la régulation des transcrits Nphp1 par ANKS3 dans ces phénotypes. Afin de préciser le mécanisme par lequel ANKS3 régule la stabilité des ARNs de Nphp1 et possiblement d'autres ARN ciliaires, nous avons étudié l'implication de son partenaire BICC1, connu pour lier et réguler les ARNs. Des analyses transcriptomiques par RNAseq et RIPseq sur des cellules ANKS3-KD en présence ou non de BICC1, ont permis de démontrer le rôle majeur d'ANKS3 au sein du complexe ANKS3/BICC1 dans la régulation de la dégradation par RISC/AGO2 de nombreux transcrits ciliaires et gènes de ciliopathies. L'ensemble de ces résultats permet de mettre en évidence un nouveau mécanisme de régulation des transcrits ciliaires par le complexe ANKS3/BICC1, dont les mutations causent des ciliopathies rénales.

  • Titre traduit

    Functional characterization of the ANKS3 protein involved in renal ciliopathies and study of its role in the RNAs regulation


  • Résumé

    Nephronophtisis (NPH) is an autosomal recessive tubulo-interstitial nephropathy characterized by the a massive interstitial fibrosis and cyst formation. NPH is the major reason for end-stage renal disease in childhood. It can be isolated or syndromic, associated with extrarenal manifestations. NPH belongs to the ciliopathies, a group of multisystemic diseases, caused by mutations in genes encoding proteins of the primary cilia. The primary cilia acts on the surface of most cells as a mechano and chemosensor controlling signaling pathways essential for tissue development and homeostasis (Shh, Wnt, PC2 / Ca2+ signaling). To date twenty-three causatives genes have been identified for NPH (including 14 in our laboratory). These codes for ciliary proteins implicated in the control of cilia protein composition and ciliary signaling, at the base of the cilium (transition zone (TZ)), at the level of the Inversin compartment (IC), or during intraflagellar transport. We identified a homozygous missense mutation in a new gene responsible for NPH associated with liver fibrosis. ANKS3 code a protein known to interact with several NPH proteins such as NPHP1 (TZ), ANKS6 and NEK8 (IC) as well as BICC1, a ribonucleoprotein mutated in renal cystic dysplasia. My thesis project has been focused on the characterization of ANKS3 function and the impact of human mutation in cellular processes relevant for renal ciliopathies. These studies were performed from different cellular models: patient fibroblasts, renal tubular cells IMCD3 depleted for Anks3 (ANKS3_KD) re-expressing the wild-type or mutated form. My work demonstrated that ANSK3 mutation decreases its interaction with the TZ component, NPHP1 and IC one, NEK8. In addition, the absence or expression of the mutated form of ANKS3 affects the cilia length and the IC biogenesis. Indeed, the IC components are abnormally relocated all along the primary cilia. Moreover, a disruption of the ciliary signaling Shh pathway and the localization of the PC2 protein at the primary cilia were observed in the ANKS3_KD or mutant cells. This last observation is confirmed by zebrafish mutated for anks3 (TALEN) model, which exhibits a decrease in ciliary motility associated with calcium signaling defetcs in the Kupffer vesicle, leading to laterality defects (situs inversus). In addition to these ciliary defects, the loss or mutation of ANKS3 causes apico-basal polarity defects in IMCD cells, with a decrease in cell height and delay in tight junction formation, a phenotype reminiscent of NPHP1 mutated models. Consistent with these results we observed a decrease in the stability of Nphp1 transcripts in ANKS3_KD and mutant cells. The re-expression of NPHP1 in these cells rescues the polarity and cilia length defects demonstrating the ANKS3 implication in the Nphp1 transcripts regulation in these phenotypes. To elucidate the mechanism by which ANKS3 regulates the Nphp1 and possibly other ciliary RNAs stability, we investigated the implication of its partner BICC1, which is known to bind and regulate RNAs. Transcriptomic analyzes notably RNAseq and RIPseq on ANKS3-KD and mutated cells in the presence or absence of BICC1, demonstrate that the absence of ANKS3 or a mutant form triggers BICC1 interaction with the targeted mRNA and the RISC-associated protein AGO2, thus addressing ciliary gene transcripts to degradation. This finding allows us to place ANKS3/BICC1 complex as a key regulator of ciliopathy-related transcripts that orchestrates the biogenesis and function of primary cilia.

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