The Renal Cysts and Diabetes syndrome : from transcriptional profiling and functional analysis of a novel mouse model to biomarkers evaluation in human patients

par Pierbruno Ricci

Thèse de doctorat en Biologie du développement

Sous la direction de Muriel Umbhauer et de Silvia Cereghini.

Soutenue le 24-09-2018

à Sorbonne université , dans le cadre de École doctorale Complexité du vivant (Paris) , en partenariat avec Laboratoire de biologie du développement (Paris) (laboratoire) .

Le président du jury était Pierre Ronco.

Le jury était composé de Petra Zürbig.

Les rapporteurs étaient Christine Perret, Adrian S. Woolf.

  • Titre traduit

    Le syndrome « Renal Cysts and Diabetes » (RCAD) : de l’analyse fonctionnelle et du profil transcriptionnel d’un nouveau modèle de souris du profil à l'évaluation de biomarqueurs chez des patients humains


  • Résumé

    Les mutations hétérozygotes du gène codant pour le facteur de transcription HNF1B sont à l'origine d'un syndrome multisystémique complexe connu sous le nom de « Renal Cysts and Diabetes » (RCAD). Un modèle de souris généré dans notre laboratoire s'est avéré reproduire plusieurs caractéristiques de la maladie humaine. Nous avons réalisé un séquençage ARNm-microARN à différents stades de développement (E14,5 ; E15,5 ; E17,5) de ce modèle. Nous avons montré que les gènes les plus dérégulés étaient impliqués dans les processus métaboliques de transport, de lipides et d’acides organiques et étaient exprimés dans les tubules proximaux et, dans une moindre mesure, dans l’anse de Henlé et les canaux collecteurs. Nous avons sélectionné quatre microARN (miR-802, 194-2, 192 et -30a), régulés à la baisse et potentiellement contrôlés par HNF1B. Des expériences de transactivation de gène rapporteur dans des cellules HEK-293 ont montré que HNF1B était capable de transactiver la transcription de ces microARN via des sites de liaison présents dans les séquences régulatrices de ces gènes. En utilisant des microARN MIMICS nous avons par la suite montré que mir-802, mir-194-2 et mir-192 étaient capables d'inhiber l’expression d’un gène rapporteur contenant la région 3'UTR de HNF1B. L'analyse d'échantillons d'urine de 22 patients RCAD et de 22 contrôles sains a permis d'identifier 146 peptides excrétés de manière différentielle et associés au syndrome. En utilisant ces résultats dans un modèle mathématique, classificateur prédit efficacement le syndrome RCAD avec une sensibilité de 91.7% et une spécificité de 91.1% sur une large population de patients.


  • Résumé

    Heterozygous mutations in the gene encoding the transcription factor HNF1B are the cause of a complex multisystem syndrome known as Renal Cysts And Diabetes (RCAD). A mouse model generated in our laboratory was shown to reproduce several features of the human disease. We performed high-throughput mRNA-microRNA sequencing at different developmental stages (E14.5, E15.5, E17.5). We showed that the most down-regulated genes were involved in transport, lipid and organic acid metabolic processes and expressed in proximal tubules and to a lesser extent in the loop of Henle and collecting ducts. We then selected four microRNAs (mir-802, 194-2, 192 and -30a), which were down-regulated and potentially controlled by HNF1B. Luciferase assays in HEK-293 cells showed that HNF1B was able to specifically transactivate in a dose response mode these microRNAs through binding HNF1B-binding sites in their regulatory promoter/enhancer upstream sequences. We subsequently showed by luciferase assays using miRNA MIMICS that mir-802, mir-194-2 and mir-192 were able to inhibit luciferase vectors containing the 3’UTR of Hnf1b. Analysis of urine samples from 22 RCAD patients and 22 healthy controls led to the identification of 146 peptides differentially excreted and associated with RCAD including a similarity regarding collagen and uromodulin fragments with the RCAD mouse model. Combining the peptides into a mathematical model we used independent cohorts of patients to validate the prediction of the RCAD syndrome. Our classifier efficiently predicted RCAD syndrome with 91.7% sensitivity and 91.1% specificity on a wide population.


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