Staphylococcus aureus Regulatory RNAs Driving Fitness upon Antibiotic Exposure

par Wenfeng Liu

Thèse de doctorat en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Philippe Bouloc.

Soutenue le 20-09-2018

à Paris Saclay , dans le cadre de Structure et Dynamique des Systèmes Vivants , en partenariat avec Institut de biologie intégrative de la cellule (Gif-Sur-Yvette, Essonne) (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement opérateur d'inscription) .

Le président du jury était Olga Soutourina.

Le jury était composé de Philippe Bouloc, Olga Soutourina, Maude Guillier, Michel Arthur, Svetlana Chabelskaia.

Les rapporteurs étaient Maude Guillier, Michel Arthur.

  • Titre traduit

    ARN régulateurs et adaptation aux antibiotiques chez Staphylococcus aureus


  • Résumé

    Staphylococcus aureus est un agent pathogène opportuniste responsable d’infections communautaires et nosocomiales pour lesquelles les traitements sont compliqués du fait de l'émergence de souches multi-résistantes. L’adaptation rapide de S. aureus à de multiples conditions de croissance contribue à sa virulence ; elle dépend de nombreux facteurs incluant la régulation des petits ARN (ARNrég). Nous avons réalisé une étude précise de tous les petits ARN de la souche modèle HG003, un dérivé de la souche NCTC8325 couramment utilisé pour les études de régulation génétique chez S. aureus. C'est une tâche complexe qui est essentielle pour réaliser des études moléculaires et fonctionnelles. Nous avons trouvé environ 50 authentiques (bona fide) petits ARN, un nombre beaucoup plus faible que précédemment rapporté. Comme la plupart des ARNrég contribuent à une « régulation fine » de l'expression génique, les phénotypes dépendants des ARNrég sont généralement difficiles à détecter. Cependant, ces phénotypes peuvent apparaître comme un caractère important après plusieurs générations sous une pression sélective. Nous avons développé une stratégie expérimentale pour mesurer l’évolution de la quantité de mutants d’ARNrég dans une population de mutants de S. aureus. Nous avons construit une collection de quatre-vingts mutants d’ARNrég dans la souche HG003. Chaque gène d’ARNrég est remplacé par une séquence d'ADN « code-barres » spécifique pour l’identification des mutants. La bibliothèque de mutants est cultivée dans différentes conditions de croissance, les codes-barres sont amplifiés par PCR et comptés par séquençage massif. Nous pouvons ainsi déterminer les mutants qui diminuent ou s'accumulent pendant une condition de stress et inférer une fonction à certains ARNrég. L'utilisation d'amorces spécifiques permet de multiplexer 50 conditions expérimentales. Nous nous sommes posés la question suivante : les ARNrég de S. aureus participent-t-ils à la résistance aux antibiotiques ? Dans ce mémoire, nous présentons des données en utilisant la méthode décrite ci-dessus. La bibliothèque de mutants d’ARNrég a été testée en présence de 10 antibiotiques ciblant les enveloppes, la synthèse des protéines, la réplication de l'ADN ou la synthèse de l'ARN. Plusieurs mutants sont affectés par les conditions de croissance testées. Par exemple, la proportion du mutant sau6836 augmente considérablement en présence de vancomycine et est réduite en présence de flucloxacilline, cloxacilline ou céfazoline. La proportion du mutant ARNIII-agr augmente progressivement en présence de gentamicine, de linézolide et de clindamycine. La proportion de mutant d'ARN 6S diminue significativement en présence de rifampicine. Il est important de noter que l'ARN 6S et la rifampicine ciblent l'ARN polymérase. L’ARNrég RsaA est un régulateur des autolysines dont l’absence affecte la survie en présence de ciprofloxacine. Ces exemples illustrent la puissance des expériences de compétition pour identifier les phénotypes dépendants des ARNrég et révèlent que plusieurs ARNrég contribuent à moduler la résistance aux antibiotiques.


  • Résumé

    Staphylococcus aureus is an opportunistic pathogen and one of the major bacteria responsible for community-acquired and nosocomial infections for which the treatment is complicated by the emergence of multidrug resistant strains. Its adaptation to multiple growth conditions, which contributes to its virulence, is under the control of numerous factors including regulatory RNAs, often called sRNAs for small RNAs. We performed an accurate survey of all sRNAs from the model strain HG003, a NCTC8325 derivative commonly used for S. aureus genetic regulation studies. It is a complex task, essential to accomplish molecular and functional studies. We found about 50 bona fide sRNAs, a number much lower than previously reported.As most sRNAs contribute to the "fine-tuning" of gene expression, sRNA-dependent phenotypes are generally difficult to detect. However, sRNA-mediated phenotypes may emerge as dominant traits after a few generations under selective pressure. We set up an experimental strategy to evaluate the fitness of S. aureus sRNA mutants within a population of sRNA mutants. A library of eighty HG003 mutants with sRNA genes replaced by specific DNA “barcode” sequences to allow the identification of each mutant was constructed. The mutant library was grown in different conditions, DNA barcodes were PCR and counted by DNA-seq. Mutants diminishing or accumulating during a stress condition provide information on sRNA functions. The use of specific primers allows multiplexing 50 experimental conditions in one DNA-seq library. We questioned whether sRNAs could affect the antibiotic resistance in S. aureus. Here, we present data using the above-described method with the sRNA mutant library tested in the presence of 10 antibiotics (targeting the cell wall and cell membrane, inhibiting the biosynthesis of protein, interrupting DNA replication and RNA synthesis of bacteria). Several mutants were affected by the tested growth conditions. For examples, the proportion of mutant sau6836 increases dramatically in vancomycin and reduces in flucloxacillin, cloxacillin and cefazolin. The proportion of RNAIII-agr mutant increases progressively in the presence of gentamicin, linezolid and clindamycin. The proportion of 6S RNA mutant decreases significantly in the presence of rifampicin. Interestingly, the 6S RNA and the rifampicin are targeting the RNA polymerase. The sRNA RsaA targets a regulator of autolytic activities and its corresponding mutant is remarkably reduced in the presence of ciprofloxacin. These examples illustrate the power of fitness experiments to identify phenotypes and reveals that several sRNAs contribute to modulate the resistance to antibiotics.



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