Impact de la composition du ribosome sur la fidélité de la traduction

par Sandra Gillot-Chafia

Thèse de doctorat en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Olivier Namy.

Soutenue le 26-06-2018

à Paris Saclay , dans le cadre de Structure et Dynamique des Systèmes Vivants , en partenariat avec Université Paris-Sud (établissement opérateur d'inscription) et de Institut de biologie intégrative de la cellule (Gif-Sur-Yvette, Essonne) (laboratoire) .


  • Résumé

    Les ribosomes, acteurs principaux de la synthèse protéique, sont constitués de protéines et d’ARNs. Ces dernières années la notion de "ribosome spécialisé" est apparue. Cela implique que les ribosomes sont hétérogènes dans leur composition protéique et les modifications chimiques des ARNr. Ces différentes populations de ribosome présenteraient des spécificités de traduction différentes. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à une modification chimique des ARNr particulière, les 2’-O-méthylations des riboses, à leur variabilité et à leur rôle dans la fidélité et la régulation de la traduction.Pour réaliser cette étude, un modèle de cellules HeLa a été créé dans lequel la synthèse de la fibrillarine, la méthyltransférase responsable des 2’-O-méthylations, est inhibée par un shRNA (small hairpin RNA) intégré de façon stable dans le génome. L’étude de l’impact de la baisse de la fibrillarine sur les 2’-O-méthylations a permis de montrer que la diminution des méthylations des ARNr est globale mais varie selon la position. Ainsi, certaines positions sont plus sensibles que d’autres à la baisse du taux de fibrillarine.J’ai tout d’abord étudié les effets de la baisse de la méthylation des ARNr sur la traduction globale, par la technique de ribosome profiling. Cette technique est fondée sur le séquençage à haut débit des fragments d’ARNm protégés par les ribosomes. J’ai ainsi pu montrer que 43 gènes candidats étaient différentiellement traduits en condition d’hypométhylation des ARNr. A partir de cette liste j’ai cherché des éléments fonctionnels et/ou moléculaires communs à plusieurs gènes candidats. J’ai par la suite montré que les taux de translecture et de décalage de cadre de lecture augmentaient quand les ARNr sont hypométhylés. La baisse de la méthylation des ARNr entraîne donc une baisse de la fidélité de la traduction.Des études précédentes ont montré que l’initiation IRES-dépendante était impactée par la baisse des méthylations des ARNr. J’ai donc réalisé une étude globale sur l’initiation de la traduction en adaptant la technique de ribosome profiling de façon à identifier spécifiquement les ribosomes en cours d'initiation. J’ai ainsi révélé que 66 sites d’initiation étaient impactés par la baisse de la méthylation des ARNr.Nous avons localisé les positions méthylées les plus impactées sur la structure 3D du ribosome. Ceci nous a permis de regrouper les modifications par région. Nous nous sommes intéressés à un groupe de méthylations conservées entre la levure et l’homme et situées au niveau du tunnel de sortie du peptide. J’ai délété chez S. cerevisiae les snoARNs responsables de ces méthylations. J’ai ensuite cherché à démontrer si la perte de ces méthylations avait un impact sur la croissance cellulaire et la sensibilité à différents antibiotiques. J'ai aussi effectué des mesures de translecture et de décalage de cadre de lecture. L’ensemble de mes résultats a montré que la délétion conjointe de trois des quatre snoARNs impliqués dans les méthylations autour du tunnel de sortie du polypeptide n'a pas d'effet sur la fidélité de la traduction.Au cours de cette étude chez la levure, j’ai révélé un effet inédit de la délétion du gène ASC1 sur la translecture des codons stop. Asc1p est une protéine plateforme associée au ribosome, dont l’absence entraîne une diminution de la translecture du codon stop. Les mécanismes moléculaires impliqués demeurent actuellement inconnus.Au cours de ma thèse, j’ai pu montrer par des approches globales et spécifiques que la baisse de la méthylation des ARNr entraînait des variations spécifiques de l’expression protéique ainsi qu’une diminution spécifique de la fidélité de la traduction. Les mécanismes moléculaires impliquées sont toujours activement recherchés.

  • Titre traduit

    Impact of ribosome composition onto translational fidelity


  • Résumé

    Ribosomes are composed of proteins and RNAs. During these last years, the concept of « specialized ribosome » has been revived. This concept is based on the principle that ribosomes are heterogeneous in protein composition and rRNA chemical modifications. These different ribosomes populations would present different translational specificities. During my thesis, I was interested in a particular rRNA chemical modification, ribose 2’-O-methylation, its variability and its role in translational fidelity and regulation.To make this study, a HeLa cell-line in which fibrillarin (the methyltransferase responsible for 2’-O-methylations) synthesis is inhibited by a shRNA (small hairpin RNA) stably integrated in the genome. The study of impact of fibrillarin decrease on 2’-O-methylations enabled us to show that rRNA methylation decrease is global but varies with the position. So, some positions are more sensitive than others positions to fibrillarin decrease.First I studied rRNA methylation decrease effects on global translation, by ribosome profiling. This method is based on high-throughput sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. By this way I revealed 43 candidate genes that are differentially translated in rRNA hypomethylated condition. From this list I searched functional and/or molecular elements common to several candidate genes. Then I showed that readthrough and frameshifting rates increase when rRNA is hypomethylated. So rRNA methylation decrease leads to translational fidelity decrease.Previous studies have shown that IRES-dependant initiation is impacted by rRNA methylation decrease. Then I performed a global study of translation initiation by adapting ribosome profiling method to identify initiating ribosomes specifically. Therefore I revealed that 66 initiation sites are impacted by rRNA methylation decrease.We localized the most impacted methylated positions on the 3D ribosome structure. It enabled us to group modifications by region. We focused our interest on one group of methylations conserved between yeast and human and localized around the peptide exit tunnel. I deleted snoRNAs responsible for these methylations in S. cerevisiae. Then I analysed if the loss of these methylations impacts the cell growth and the antibiotics sensitivity. I also make measures of readthrough and frameshifting. My results show that the targeted deletion of three out of four snoRNAs involved in the methylations around the peptide exit tunnel has no effect on translational fidelity.During this study in yeast, I revealed an unprecedented effect of ASC1 gene deletion on stop codons readthrough. Asc1p is a scaffold protein associated with the ribosome, whose absence causes a decrease of codon stop readthrough. Currently molecular mechanisms implicated remain unknown.During my thesis, I showed with global and specific approaches that rRNA methylation decrease leads to specific variations of protein expression together with specific decrease of translational fidelity. Molecular mechanisms are still actively investigated.



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