Elaboration of New Layer by Layer (LbL) Fluorescent thin films and their functionalization for the sensitive detection of bacteria

par Yayang Tian

Thèse de doctorat en Chimie

Sous la direction de Gilles Clavier et de Rachel Méallet-Renault.

Le président du jury était Marie Erard.

Le jury était composé de Gilles Clavier, Rachel Méallet-Renault, Marie Erard, Eléna Ishow, Andrey Klymchenko, Bianca Sclavi, Donal O'Shea.

Les rapporteurs étaient Eléna Ishow, Andrey Klymchenko.

  • Titre traduit

    Élaboration de films minces fluorescent couche par couche (LbL) et fonctionalisation pour la détection sensible de bactéries


  • Résumé

    Les antibiotiques ont été utilisés pour le traitement des infections bactériennes depuis plus de 70 ans, sauvant des millions de vies. Cependant, leur mauvaise et sur-utilisation ont conduit à l’émergence de la résistance bactérienne. Outre le développement de nouvelles familles d'antibiotiques, la détection rapide et sensible de bactéries est très importante pour le diagnostic médical. Les polymères fluorescents représentent un grand potentiel, car ils sont faciles à fonctionnaliser, synthétiser et greffer. Les films sont plus pratiques, faciles à manipuler et peuvent être réutilisés, ce qui n'est pas le cas des méthodes de détection en solution. L’objectif de ce travail est de développer un film de polymère nanostructuré fluorescent et sensible sur des surfaces de verre pour la détection bactérienne. Sur la base de la méthode de polymérisation radicalaire par transfert de chaîne réversible par addition-fragmentation (RAFT), trois types de polyélectrolytes fluorescents à base de BODIPY (FPC) ont été synthétisés : des chaînes relativement courtes à caractère polyélectrolyte faible (SW FPC), des chaînes courtes à caractère polyélectrolyte fort (SS FPC) et enfin des chaînes longues à caractère polyélectrolyte faible (FPC LW). Les films FPC LbL ont été élaborés sur des lames en verre par interaction électrostatique. Les propriétés photophysiques et de surface des FPC LbL ont été contrôlées en ajustant les conditions de dépôt. Les films FPC LbL à base de BODIPY ont été utilisés comme dispositif de première génération pour la détection de E. coli. Dans l'étape suivante, la sensibilité des films a été augmentée en utilisant le principe de fluorescence exaltée par plasmon (Metal Enhanced Fluorescence MEF). Un film LbL -MEF a été préparé et testé pour la détection de bactéries. Des nanoparticules d'or sphériques (Au NPs) ont été synthétisées et recouvertes de poly(chlorhydrate d'allylamine) (PAH). Le FPC LW a été sélectionné comme couche fluorescente. Différents films contenant des Au NPs et LW FPC- ont été fabriqués. La distance entre les NPs Au et LW FPC- a été ajustée par l'ajout de deux polymères de charge opposée (PC + et PC-). Les deux surfaces de AuNP / 4 couches PC / LWFPC- et Au NPs / 8 couches PC / LWFPC- ont montré que E. coli peut être ciblée par LW FPC-.La sélectivité des films LbL a été ajoutée en introduisant un anticorps comme site de reconnaissance spécifique. Le polyanion et le polycation avec le groupe fonctionnel 4-dibenzocyclooctynol (DIBO) ont été assemblés sur des lames de verre activées. L'anticorps anti-E. coli a ensuite été introduit sur la surface en une seule étape via la réaction de cycloaddition azide-alcyne (SPAAC). Le nombre d'E. coli capturées dépend de la concentration d’anticorps sur la surface. La surface a montré une sélectivité significative pour E. coli, comparée à B. subtilis.La croissance bactérienne peut être détectée sur un film mince LbL en introduisant un fluorophore sensible au pH (fluorescéine). En effet, la croissance des bactéries est souvent associée à une diminution du pH du milieu due à une libération de métabolites acides. Nous avons préparé avec succès différents types de films LbL sensibles au pH. Dans un premier temps, la synthèse de différents polyanions fonctionnalisés (chaîne courte et longue de DIBO-PC et polymère fluorescent rouge) a été achevée. Ensuite, trois types de surfaces sensibles au pH contenant de la fluorescéine (DIBO-SWPC- / fluorescéine, DIBO-LW PC- / fluorescéine et ratiométrique RFPC- / fluorescéine) ont été préparés sur la base d'assemblage LbL et de chimie click. Enfin, trois surfaces sensibles au pH ont été étudiées pour la détection de la croissance des bactéries. Toutes les surfaces étaient biocompatibles, le nombre de E. coli augmentait même après plusieurs heures d'incubation sur chaque surface. La détection par le changement de fluorescence est en cours de développement.


  • Résumé

    Antibiotics have been used for the treatment of bacterial infections for over 70 years, saving millions of lives. The current antibiotic resistance crisis has been attributed to the overuse and misuse of these medications. Therefore, the prevention of infection transmission by the rapid and sensitive detection of antibiotic resistant strains is needed in managing this crisis. Fluorescent polymers show great potential for bacteria detection, because they are easy to functionalize, reproduce and graft. Compared with the methods used for bacterial detection in liquid, bacterial detection on a film surface is more convenient, easier to handle and is applied in devices that can be easily reused. The goal of my PhD work is to develop fluorescent and sensitive nanostructured polymer films on surfaces for bacterial detection. Three types of BODIPY-based fluorescent polyelectrolytes (FPC) with different features were synthetized based on reversible addition-fragmentation transfer (RAFT) polymerization: relatively Short chains and Weak polyelectrolytes (SW FPC), Short chains and Strong polyelectrolytes (SS FPCs) and Long chains and Weak polyelectrolytes (LW FPCs). FPC LbL films were fabricated on activated glass slides by means of electrostatic attraction. The photophysical and surface properties of FPC LbL fims were easily controlled by adjusting the deposition conditions.The following step aimed at increasing the films’ sensitivity by using the metal-enhanced fluorescence (MEF) principle. A MEF based LbL film was prepared and tested for bacteria detection. Spherical gold nanoparticles (Au NPs) were synthesized and coated with poly(allylamine hydrochloride) (PAH). The LW FPC- was selected as the fluorescent layer. Different films containing Au NPs and LW FPC- were fabricated and the distance between the Au NPs and LW FPC- was adjusted by changing the numbers of layers with two oppositely charged polymers (PC+ and PC-). Both Au NPs/4 layers PCs/LWFPC- and Au NPs/8 layers PCs/LWFPC- surfaces indicated that E. coli can be detected by LW FPC-.The selectivity of LbL films was added by introducing an antibody on the surface of the film to provide specific recognition of a chosen bacterial strain. This LbL surface achieved a rapid, effective and specific detection of E. coli bacteria. The polyanion and polycation with a 4-dibenzocyclooctynol (DIBO) functional group were assembled on the activated glass slides and an anti-E. coli antibody containing an azide group was efficiently introduced on the surface in a single step based on the azide-alkyne cycloadditions (SPAAC) reaction. The number of E. coli captured on the surface was shown to be dependent on the amount of antibody on the surface. The anti-E. coli antibody surface showed significant selectivity for E. coli, compared with B. subtilis. An alternative approach is to detect bacterial growth on thin LbL film by introducing pH sensitive fluorophore (fluorescein). The growth of bacteria is often associated with a decrease in pH of the growth medium due to a release of acidic metabolites. Different types of pH sensitive LbL film were prepared and tested for the detection of bacterial growth. Firstly, the synthesis of different functionalized polyanions (short and long chain of DIBO-PC- and red fluorescent polymer) was carried out. Three types of pH sensitive surfaces containing fluorescein (DIBO-SWPC-/fluorescein, DIBO-LW PC-/fluorescein and ratiometric RFPC-/fluorescein surfaces) were prepared based on the combination of LbL assembly and copper-free click chemistry. Finally, three pH sensitive surfaces were studied for bacteria growth detection. All the surfaces were shown to be biocompatible, the number of E. coli increased after several hours of incubation on each surface, as detected by brightfield microscopy imaging. The application for the fluorophore-dependent detection of bacterial growth remains to be developed.


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