Analyse protéomique des endosulfatases humaines HSulfs, enzymes clés de la modulation de la sulfatation de l’héparane sulfate

par Ilham Seffouh

Thèse de doctorat en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Régis Daniel.

Le président du jury était Jérôme Ausseil.

Le jury était composé de Régis Daniel, Jérôme Ausseil, Fabrice Allain, Sandrine Sagan, Florence Gonnet, Cédric Przybylski.

Les rapporteurs étaient Fabrice Allain, Sandrine Sagan.


  • Résumé

    Les endosulfatases HSulf-1 et HSulf-2 (EC : 3.1.6.- ; sulfo-esterase) sont des 6-O-endosulfatases récemment découvertes. Elles catalysent l’hydrolyse du groupe 6-O sulfate des résidus glucosamines sulfatés de l’héparane sulfate (HS), un glycosaminoglycane constituant un réseau de polysaccharides linéaires sulfatés à la surface cellulaire. Un certain nombre de données de la littérature montrent que l’enchaînement disaccharidique ainsi que le profil de sulfatation de HS gouvernent la spécificité de liaison d’un certain nombre de ligands, et jouent ainsi un rôle important dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques.A ce jour, l’organisation structurale de HSulf-1 et HSulf-2 demeure mal connue. Synthétisées sous forme d’une protéine qui devient mature après clivage par la furine, ces deux endosulfatases présentent une organisation moléculaire commune constituée de deux chaînes reliées vraisemblablement par des ponts disulfures. Les travaux réalisés ont eu pour objectif la caractérisation structurale HSulf-2, par des approches combinant des méthodes biochimiques et de protéomique basées entre autres sur la spectrométrie de masse (MS).Les résultats obtenus ont permis la détermination expérimentale des valeurs de masses de l’enzyme HSulf-2 entière et de chacune de ses deux chaînes, la mise en évidence du résidu formyl-glycine requis au site actif pour l’activité catalytique, et pour la première fois le séquençage protéique de cette endosulfatase humaine. Une attention particulière est portée à la détermination des modifications post-traductionnelles (ponts disulfure, glycosylations) à l'aide de marquages chimiques différentiels, de traitements par de multiples protéases et glycosidases et de MS, ce qui a permis de localiser les sites potentiels de N-glycosylation. Outre la N-glycosylation, cette étude a aussi révélé une O-glycosylation singulière de HSulf-2, qui a également été caractérisée.L’ensemble des données obtenues suggèrent des particularités structurales spécifiques de HSulf-2, liées par exemple à des propriétés de repliement ou de modifications post-traductionnelles qui pourraient expliquer les observations inhabituelles faites en électrophorèse sur gel et en MS. Au-delà, ces résultats constituent la première analyse par MS de l’endosulfatase humaine HSUlf-2, qui jusqu'à présent demeurait un objet protéique difficile du point de vue de son analyse.

  • Titre traduit

    Proteomic analysis of human endosulfatases HSulfs, key enzymes in the modulation of the sulfation pattern of heparan sulfate


  • Résumé

    The human endosulfatases HSulf-1 and HSulf-2 are two extracellular 6-O-endosulfatase enzymes recently discovered. They remove 6-O sulfate group from glucosamine residue in heparan sulfate (HS), a glycosaminoglycan located on cell surface. It is assumed that HS sulfation pattern may host an informational content governing the recognition and the interaction of HS with various ligands. By varying the HS sulfation pattern, HSulf-1 and HSulf-2 have a strong impact on HS-ligand interactions, and consequently they are involved in many physiological and pathological processes.To date, the structural organization of HSulfs remains elusive. Some pieces of information revealed that both HSulf isoforms have a common molecular organization consisting of two chains presumably linked by disulfide bonds, and their maturation into active form requires a cleavage by furin. The objectives of this work were to achieve the fine structural characterization of HSulf-2 using a combination of biochemical and mass spectrometry (MS) approaches. The study provides among others, the experimental mass value of the whole HSulf-2 enzyme and of its two chains, the evidence of a formylglycine residue at the catalytic site required for sulfatase activity, and the first sequencing of this human enzyme at the protein level. Particular attention has been paid to the determination of post-translational modifications (disulfide bond, glycosylation) using differential chemical labeling, treatments by multiples proteases and glycosidases, and MS methods, allowing the location of potential N-glycosylation sites. Besides N-glycosylation, this study revealed also a unique O-glycosylation of HSulf-2, which has been characterized. In overall, the obtained data suggest specific structural features (folding, post-translational modifications) of HSulf-2, which may explain the observed unexpected electrophoretic and MS properties. Beyond these results, it is the first detection and characterization by MS (ESI and MALDI) of the human HSulf, which to date remained an elusive enzyme from the bioanalytical point of view.


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Informations

  • Sous le titre : Analyse protéomique des endosulfatases humaines HSulfs, enzymes clés de la modulation de la sulfatation de l'héparane sulfate
  • Détails : 1 vol. (199 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 13-16.
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