Développement d’approches PCR et implémentation pour l’amélioration de l’accès au diagnostic moléculaire des maladies infectieuses dans les pays à ressources limitées

par Sylvie Zida

Thèse de doctorat en Biologie Santé

Sous la direction de Edouard Tuaillon et de Albert Sotto.


  • Résumé

    Les tests moléculaires sont fréquemment demandés pour le diagnostic et le suivi des maladies infectieuses dans les pays développés. Cependant, sa disponibilité reste limitée dans les pays à ressources limitées dû à des contraintes de coûts, des technologies et des ressources humaines. Dans les régions éloignées, un accès limité aux installations de laboratoire constitue également un problème majeur. Le développement de méthodes de PCR sur plateformes ouvertes dans des laboratoires de référence tels que le Centre MURAZ au Burkina-Faso et l'utilisation d’échantillons de sang total capillaires sur DBS peuvent faciliter l'accès aux tests moléculaires.Selon la directive de l'OMS, la quantification de l'ARN du VIH à l'aide de DBS peut être une alternative dans les contextes d’accès difficile au laboratoire. Une préoccupation majeure est la spécificité sous-optimale de l’utilisation des DBS en raison de l'interférence de l'ADN du VIH archivé dans des cellules infectées sur la charge virale ARN du VIH. Dans une première étude, nous avons déterminé le niveau d'ADN du VIH-1 qui entravait la fiabilité de la quantification de l'ARN du VIH-1 sur des DBS. Une détection d'ARN du VIH-1 faussement positif (22/62, 35%) a été associée à des niveaux élevés d'ADN de VIH-1. Nos résultats indiquent que la spécificité des tests d'ARN du VIH-1 sur les DBS devrait être évaluée suivant les protocoles du fabricant sur les échantillons avec des niveaux d'ADN de VIH-1 de ≥1 000 copies / 106 cellules mononuclées du sang périphérique.Outre les infections fréquemment diagnostiquées, il est urgent d'intensifier la recherche d’infections négligées comme la leptospirose. Dans une seconde étude, nous avons exploré la leptospirose par des tests sérologiques et moléculaires comme cause négligée de maladie chez les patients atteints d’ictère fébrile au Burkina Faso. Les résultats ont montré pour la première fois que la leptospirose est une cause insoupçonnée de maladie fébrile aiguë dans ce pays semi-aride.Dans la dernière partie du doctorat, nous avons développé un test de PCR multiplex pour le diagnostic de la méningite à herpès simplex virus (HSV) et à Mycobacterium tuberculosis (MTB) chez des patients suspects de méningite aseptique. Cette qPCR qui a permis de tester dans un seul essai HSV 1/2 et MTB était très spécifique, sensible et reproductible. La concentration d'ADN la plus faible donnant 100% de signal de détection a été estimée à 2,12 copies / μl pour HSV1, 1,76 pour HSV2 et 2,15 copies / μl pour MTB. Parmi les 202 échantillons de LCR inclus dans cette étude, 5 (2,46%) étaient positifs: 2 (0,99%) pour HSV et 3 (1,47%) pour MTB. Ce test peut être particulièrement utile dans les cas de méningite / encéphalite avec un faible nombre de globules blancs dans le CSF.Notre projet a montré l'importance de la mise en œuvre de nouvelles méthodes moléculaires pour fournir des données préliminaires sur le fardeau des maladies infectieuses, y compris la leptospirose, la tuberculose et la méningite à HSV au Burkina Faso. Le DBS est un spécimen alternatif qui facilite l'accès aux tests moléculaires mais nécessite des études de validation. Les approches syndromiques doivent être testées et mises en œuvre dans les pays à ressources limitées en se basant sur l'expertise locale et la mise en œuvre de méthodes moléculaires dans les laboratoires de référence.

  • Titre traduit

    Development and implementation of nucleic acid tests for diagnosis of infectious diseases in resource-limited countries


  • Résumé

    Molecular assays are frequently requested for the diagnosis and monitoring of infectious diseases. While nucleic acid testing is the standard of care in developed countries, its availability remains limited and constrained by cost, technologies, and human resources in many settings, including West Africa. In remote areas, limited access to laboratory facilities is also a main issue. The development of PCR methods on open polyvalent platform in reference laboratories such as the Centre Muraz in Burkina-Faso and the use of capillary whole blood collected on DBS specimens can facilitate access to nucleic acid testing.According to WHO guideline HIV-RNA quantification using DBS can be considered in settings where there is a lack of access to sites or nearby laboratory facilities for nucleic acid test. A major concern is the suboptimal lower specificity of DBS due to the interference of HIV-DNA copies archived in infected cells with HIV-RNA copies. In the first study we determined the HIV-1 DNA level that interfered with the reliability of HIV-1 RNA quantification on DBS specimens used for therapeutic monitoring (1). False-positive HIV RNA detection (22/62, 35%) was associated with high HIV-1 DNA levels. Our results indicate that the specificity of HIV-1 RNA assays on DBS should be evaluated following manufacturer protocols on samples with HIV-1 DNA levels of ≥1,000 copies/106 peripheral blood mononuclear cells.Beside infections frequently tested by nucleic acid tests there is an urgent need to scale up assay for neglected infection such leptospirosis. In the second study we explored leptospirosis by serological and molecular testing as a neglected cause of disease among patients with febrile icteric illness in Burkina Faso. The results showed for the first time that leptospirosis is an unsuspected cause of acute febrile illness in this semi-arid country.In the last part of the PhD, we developed a multiplex PCR assay for the diagnosis of tuberculosis and Herpes Simplex (HSV) meningitis among patients with suspected aseptic meningitis. This qPCR which allowed to test in a single run HSV 1/2 and M. tuberculosis was highly specific, sensitive and reproducible. The lowest DNA concentration giving 100% detection signal was estimated at 2.12 copies/µl for HSV1, 1.76 for HSV2 and 2.15 copies/µl for M. tuberculosis. Of the 202 CSF specimens included in this study, 5 (2.46%) were tested positive: 2 (0.99%) for HSV and 3 (1.47%) for M. tuberculosis. This assay may be especially useful in cases of meningitis/encephalitis with a low number of white blood cells count in the CSF.Our project stresses the importance of the implementation of news molecular methods to provide preliminary data about the burden of infectious diseases including leptospirosis, tuberculosis and HSV meningitis in Burkina Faso. DBS is an alternative specimen that facilitates access to nucleic acid tests but requires validation studies. Syndromic approach need to be tested and implemented in West Africa and should be based on local expertise and implementation of molecular methods in reference laboratories.


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