Identification of PLK1 as a proviral factor for the hepatitis B virus replication : A possible target for antiviral and anticancerous drug development

par Adrien Foca

Thèse de doctorat en Virologie et cancérologie

Sous la direction de David Durantel.

Soutenue le 14-12-2018

à Lyon , dans le cadre de École Doctorale de Biologie Moléculaire Intégrative et Cellulaire (Lyon) , en partenariat avec Université Claude Bernard (Lyon) (établissement opérateur d'inscription) et de Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon (laboratoire) .

Le président du jury était Agnès Bernet.

Le jury était composé de David Durantel, Thomas Baumert, Christine Neuveut.

Les rapporteurs étaient Dina Kremsdorf, Joachim Lupberger.

  • Titre traduit

    Développement et utilisation d'ARN interférents dirigés contre PLK1 dans le cadre d'une infection chronique par le virus de l'hépatite B


  • Résumé

    Dans les régions de fortes endémicités, 70-80% des carcinomes hépatocellulaires sont induits par le VHB. Bien qu’un vaccin prophylactique très efficace existe, il n’est d’aucune utilité pour les 250 millions de personnes chroniquement infectées. Les traitements actuels pour contrôler l'infection chronique par le VHB montrent des limites et le besoin de nouvelles thérapies se fait ressentir. La Polo-like kinase-1 (PLK1), qui joue un rôle essentiel dans la mitose et est surexprimée dans de nombreux cancers, représente une cible prometteuse. Outre son rôle lors de la division cellulaire, PLK1 est impliquée dans la régulation de l'expression des gènes en interphase. Il a été montré que la protéine X du VHB (HBx) active PLK1 dans des modèles de cellules murines. Cependant, il restait à déterminer si PLK1 jouait un rôle au niveau de la réplication du VHB dans des hépatocytes quiescents. Des études récentes ont mis en évidence un lien positif entre l'activation de PLK1 et la réplication du VHB. Le but de ce projet de thèse a été d'étudier le(s) mécanisme(s) par le(s)quel(s) PLK1 jouait un rôle positif sur la réplication virale, avec pour objectif futur d'explorer l’inhibition de PLK1 comme cible antivirale. L'interaction entre PLK1 et la réplication du VHB a d'abord été décrite à l'aide du modèle HepAD38. Dans ce contexte, l'ADN viral est intégré dans le génome hôte, sous le contrôle d'un système d'expression Tet-off. La transcription de l'ARN prégénomique (pgRNA), à la base de la réplication virale, est initiée par la suppression de tétracycline. Dans ce contexte, l'augmentation de l'expression de PLK1 est corrélée avec la régulation négative de deux protéines; SUZ12 et ZNF198, faisant partie de complexes de remodelage de la chromatine. L'inhibition de PLK1 bloque la réplication du VHB, en agissant au niveau de la transcription virale. D'autre part, dans les modèles de réplication du VHB qui miment au mieux une infection, comprenant les hépatocytes primaires humains (PHH) et les cellules non transformées/différenciées HepaRG (dHepaRG), où le VHB se réplique dans des cellules quiescentes, nous avons mis en évidence que: 1) L'inhibition pharmacologique de PLK1 bloque la réplication virale, semblablement en perturbant l’encapsidation du pgRNA via une interaction avec la protéine core du VHB (HBc). 2) Un knocking-down de PLK1 en utilisant des ARN interférents délivrés par nanoparticules lipidiques résulte en une forte baisse de la production de pgRNA et dans la sécrétion des antigènes HBeAg/HBsAg, sans impact sur la viabilité cellulaire. Ce projet a donc permis la preuve de concept que PLK1 pouvait être une cible thérapeutique afin de controler la réplication du VHB. De plus, grâce à la technologie de délivrance par nanoparticules lipidiques d’ARN interférents, nous avons pu cibler spécifiquement les hépatocytes, augmentant de ce fait la spécificité et l’efficacité de nos traitements. Un travail sur la compréhension précise des méchanismes cellulaires impliqués permettra de mieux cerner cette interaction hôte/virus afin de poursuivre le développement de stratégies antivirales innovantes portant sur l’inhibition de PLK1. De manière significative, l'inhibition de PLK1 est non toxique pour les cellules quiescentes par rapport à des cellules cancéreuses à fort taux réplicatif, ce qui fait de PLK1 une cible thérapeutique attrayante. Des inhibiteurs spécifiques sont déjà en essais cliniques pour certains cancers (e.g., Volasertib pour le traitement de la leucémie myéloïde aiguë) et pourraient servir de thérapie bimodale dans le cadre de patients infectés par le VHB, en inhibant la réplication virale, ainsi qu’en prévenant l'émergence de cellules néoplasiques. L'inhibition de la PLK1 est une approche antivirale innovante, qui, en combinaison avec les thérapies actuelles de type IFN-α ou analogues nucléotidiques offre de grandes promesses pour endiguer l'infection chronique par le VHB mais également prévenir les événements carcinogéniques


  • Résumé

    In highly HBV endemic regions, 70-80% of hepatocellular carcinoma cases are attributable to this virus. Despite the existence of an HBV vaccine, the World Health Organization estimates 240 million individuals are chronically infected with HBV worldwide. Current antiviral treatments to control chronic HBV infections, and consequently reduce the incidence of liver cancer, are ineffective. New and effective therapies are needed not only for fighting the virus but also to prevent HCC emergence or progression. The polo-like-kinase 1 (PLK1), which plays pivotal roles in mitosis and is over-expressed in many human cancers, represents a promising druggable target in oncology. Beside its role during cell division, PLK1 is also thought to be involved in gene expression regulation during interphase. It was shown that the X protein (HBx) could activate PLK1 in murine cell transformation models. Yet it remained to be determined whether PLK1 could also play a role for HBV replication in non-dividing hepatocytes. Our, and collaborators, recent studies have identified a positive link between PLK1 activation and HBV replication. The goal of this thesis project was to investigate the mechanism(s) by which PLK1 exerts a positive effect on HBV replication, with the future goal of exploring PLK1 as an antiviral target. The interplay between PLK1 and HBV replication was firstly described using the HepAD38 cellular model of HBV replication. In this context, the HBV DNA is stably integrated into the host genome, under control of a Tet-off expression system. Transcription of HBV pregenomic RNA (pgRNA), the template of viral replication, is initiated by tetracycline removal. It has been shown that in HBV-replicating HepAD38 cells, increased PLK1 expression correlates with down-regulation of two proteins that are components of chromatin modifying complexes; SUZ12 protein of the PRC2 complex, and ZNF198 of the LSD1-CoREST-HDAC1 complex. PLK1 inhibition was described to inhibit HBV replication by reducing viral transcription. How PLK1 regulates HBV transcription remains unknown. On the other hand, in HBV replication models that resemble physiologic HBV infection, comprised of Primary Human Hepatocytes (PHH) and non-transformed/differentiated HepaRG cells (dHepaRG), where HBV replicates in non-transformed and non-dividing cells, thus enabling the study of the inter-phasic role of PLK1, irrespective of its well-established cell division implication, we have demonstrated that: 1) A pharmacological inhibition of PLK1 suppressed HBV replication by a different mechanism, likely targeting the packaging of pgRNA by the HBV core antigen (HBc). 2) Knocking-down PLK1 using siRNA delivered by lipid nanoparticles (LNP siPLK1) results in a strong drop of HBV DNAs, RNAs and HBe/HBsAg secretion without affecting the cell viability. This thesis project brought the proof of concept that PLK1 could be a drug target in HBV infection. Furthermore, the use of LNP allowed us to improve the delivery of siPLK1 to hepatocytes. Significantly, PLK1 inhibition is not toxic to quiescent cells in comparison to fast growing cancer cells, rendering PLK1 an attractive therapy target. High level of viremia in chronic HBV patients is a risk factor for progression to liver cancer. PLK1 specific inhibitors are already in clinical trials for other types of cancer (e.g., acute myeloid leukaemia) and could serve as bimodal therapy in HBV infected patients, by inhibiting virus replication as well as preventing emergence and spreading of neoplastic cells. This project was part of a full-working group of experts and thus, has beneficiated of a strong support. The proximity of the oncology-specialized hospital, the Centre Léon Bérard provided us with fresh hepatic biopsy [etc...]


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