When engineering new recombinant factor IX molecules meets gene therapy : improvement of factor IX plasma level in patients with haemophilia B?

par Sandra Le Quellec

Thèse de doctorat en Hématologie

Sous la direction de Claude Négrier et de Nathalie Enjolras.

Soutenue le 28-11-2018

à Lyon , dans le cadre de École Doctorale Interdisciplinaire Sciences-Santé. (Villeurbanne) , en partenariat avec Université Claude Bernard (Lyon) (établissement opérateur d'inscription) et de Hémostase, Inflammation et Sepsis (laboratoire) .

Le président du jury était Amit Nathwani.

Le jury était composé de Claude Négrier, Nathalie Enjolras, Christine Trouillot-Vinciguerra.

Les rapporteurs étaient Cécile Denis, Yves Gruel, Thierry Vandendriessche.

  • Titre traduit

    Quand la création de nouvelles molécules recombinantes de facteur IX de la coagulation rencontre la thérapie génique : pourrait-on davantage améliorer le niveau plasmatique de facteur IX chez les patients hémophiles B ?


  • Résumé

    Introduction : L’hémophilie B (HB) est une maladie hémorragique héréditaire caractérisée par un déficit en facteur IX (FIX) de la coagulation. La thérapie génique de l’HB par injection de virus adéno-associés (AAV) montre des résultats prometteurs, mais entraine une toxicité hépatique à forte dose. La création de nouveau transgène de FIX permettant d’injecter de moindres doses d’AAV est un réel enjeu. Matériel et Méthodes : Des transgènes thérapeutiques exprimant une protéine humaine de FIX à demi-vie prolongée par fusion à l’albumine (hFIX-Alb) ou exprimant un FIX une activité spécifique augmentée, le hFIX-E410H, ont été créés et injectés à des modèles murins. Une nouvelle molécule recombinante de hFIX à demi-vie prolongée par fusion à la sous-unité B du FXIII via un linker clivable par le facteur X activé (hFIX-LXa-FXIIIB) a été crée, produite et caractérisée. Résultats : Le transgène hFIX-Alb n’accumulait pas le niveau plasmatique du FIX par rapport au FIX sauvage. Des expériences ont été entreprises pour comprendre les mécanismes responsables du défaut d’expression. Le transgène hFIX-E410H, montrant une activité spécifique augmentée in vitro et in vivo chez les souris HB, permettait de diminuer les doses d’AAV d’environ 2,5 fois. La molécule hFIX-LXa-FXIIIB était fonctionnelle, corrigeait la génération de thrombine chez les souris HB, et présentait une demi-vie augmentée 3,9 fois chez la souris et 2,3 fois chez le rat. Conclusion : Nous avons développé et caractérisé de nouveaux transgènes de FIX modifiés et une nouvelle molécule de FIX à demi-vie prolongée, qui pourraient constituer de nouvelles perspectives thérapeutiques de l’HB


  • Résumé

    Introduction: Haemophilia B (HB) is an inherited bleeding disorder due to coagulation factor IX (FIX) deficiency. Adeno-associated virus (AAV)-based gene therapy for HB has shown promising results but can cause liver toxicity after administration of high dose of AAV vectors.The design of new transgene expressing modified FIX that would allow injecting fewer doses of AAV is a real challenge. Materials & Methods: Therapeutic transgene expressing human FIX with prolonged half-life due to fusion to mature albumin (hFIX-Alb) or expressing FIX with improved specific activity, hFIX-E410H, were designed and injected to murine animal model. A novel recombinant FIX molecule exhibiting enhanced half-life through fusion to the FXIIIB subunit via activated factor X-cleavable linker was design, produced and characterised. Results: The hFIX-Alb transgene did not increase the plasma FIX clotting activity compared to the transgene expressing wild-type hFIX. Experiments were undertaken to understand the mecanisms responsible for lower expression. The hFIX-E410H transgene, which showed improved specific activity in vitro and in vivo in HB mice, allowed injecting a 2.5-fold lower dose of AAV. The hFIX-LXa-FXIIIB molecule was functional, corrected the generation capacity in HB mice, and exhibited a 3.9-fold and 2.2-fold enhanced half-life in mice and in rats, respectively, compared to wild-type FIX. Conclusion: We have developed and characterised new transgenes expressing modified FIX, and a novel FIX molecule with prolonged half-life, which could become interesting perspectives for the treatment of HB


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