Characterization and impact of the hydrodynamics on the performance of umbilical-cord derived stem cells culture in stirred tank bioreactors

par Céline Loubière

Thèse de doctorat en Génie des procédés, des produits et des molécules

Sous la direction de Eric Olmos et de Emmanuel Guedon.

Le président du jury était Jack Legrand.

Le jury était composé de Giuseppina Montante, Marie-Laure Collignon, Emma Petiot.

Les rapporteurs étaient Jack Legrand, Giuseppina Montante.

  • Titre traduit

    Caractérisation et impact de l’hydrodynamique sur les performances de procédés de culture de cellules souches issues de cordons ombilicaux en réacteur agité


  • Résumé

    Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) interviennent de plus en plus dans le domaine de la médecine régénérative, notamment pour traiter des maladies aujourd’hui difficilement curables avec les moyens actuels. Deux verrous scientifiques limitent pourtant leur utilisation et leur commercialisation. D’une part, de grandes quantités de cellules sont nécessaires pour répondre à la forte demande médicale. D’autre part, les cellules étant elles-mêmes le médicament final, délivré chez le patient, leur qualité doit être préservée (phénotype souche, capacité de différenciation). La mise en culture de ces cellules, sur des microporteurs, en bioréacteur agité, semble répondre à ces enjeux. Cependant, une connaissance plus précise de l’impact, sur la réponse physiologique des cellules, des technologies utilisées et de l’hydrodynamique générée est nécessaire pour améliorer les lois d’extrapolation des bioréacteurs de culture de CSM. Dans ce contexte, des travaux ont été mis en œuvre pour étudier l’influence du mode d’agitation (orbital ou mécanique) sur l’attachement, l’expansion et le détachement de CSM issues de la gelée de Wharton (GW-CSM) de cordons ombilicaux, sur des microporteurs de différentes compositions. Pour contribuer à la quantification de l’expansion cellulaire, une méthode de comptage automatique in situ a été développée pour estimer le nombre de cellules par microporteur, ainsi que leur répartition, sans avoir à procéder à leur détachement. Des microporteurs commerciaux ont ensuite pu être comparés à des microporteurs synthétisés dans un laboratoire partenaire, en termes d’attachement et expansion cellulaire, ainsi que de facilité de détachement. En parallèle de ces travaux, l’impact de la conception du mobile d’agitation, en bioréacteur mécaniquement agité, sur la mise en suspension de microporteurs a été analysé. A l’issue de cette étude, une analyse dimensionnelle et des simulations CFD ont été mises en place et deux modèles reliant la fréquence minimale de juste mise en suspension (Njs) avec la géométrie du mobile d’agitation (forme, taille, position dans la cuve) et les propriétés matérielles des particules et de la phase liquide ont été proposés. Une stratégie d’optimisation des paramètres géométriques d’un mobile en minibioréacteur, dédié à la culture de CSM sur microporteurs, a été mise en place, à partir de paramètres caractérisant les contraintes hydromécaniques perçues par la phase solide, judicieusement choisis et intégrés lors des simulations CFD. Selon un plan d’expérience, et les résultats extraits des simulations, des surfaces de réponse ont été construites et une optimisation multi-objective a été réalisée afin de déterminer la géométrie minimisant les contraintes perçues par les particules, et donc par les cellules adhérées. Des cultures de GW-CSM en minibioréacteurs équipés de différents mobiles ont finalement été validées, avec une comparaison préliminaire de l’impact de ces géométries sur l’expansion cellulaire


  • Résumé

    Mesenchymal stem cells (MSC) are becoming increasingly involved in the regenerative medicine field, particularly to treat diseases that are not effectively curable with the current therapies. Two scientific barriers are nevertheless responsible for MSC use and commercialization limitations. On one side, large amounts of cells are needed to reach the high cell dose requirements. On the other side, cells being the final product themselves, directly injected into the patient, their quality have to be controlled (stem cell phenotype, differentiation capability). MSC cultivation on microcarriers in a stirred bioreactor seems to meet these challenges. However, a precise knowledge about the impact of the technologies and the hydrodynamics generated, on the physiological cell response, is necessary to improve the scale-up of MSC cultures in bioreactors. In this context, present work is dedicated to the study of the impact of the agitation mode (orbital or mechanical) on the cell attachment, expansion and detachment on various microcarrier types, in the case of MSC derived from the Wharton’s jelly (WJ-MSC) of umbilical cords. To quantify more precisely cell distribution and expansion on microcarriers, an automatic and in situ counting method was developed, which need no detachment step. This allowed the identification of commercial microcarriers suitable for WJ-MSC cultures, which were then compared to home-made microcarriers, synthesized by a partner laboratory, in terms of cell attachment and expansion, and detachment efficiency. In parallel to these works, the impact of the impeller design on the microcarrier suspension in stirred tank bioreactors was investigated. Based on a dimensional analysis and CFD simulations, it resulted in the establishment of two models relating the minimal agitation rate to ensure all particle suspension (Njs) with the impeller geometrical characteristics (design, size, off-bottom clearance) and the material properties of both the solid and the liquid phases. CFD models validation allowed then to develop a strategy to optimize the geometrical configuration of an impeller, dedicated to MSC cultures on microcarriers in a minibioreactor. Parameters characterizing the hydromechanical stress encountered by the solid phase were wisely chosen and integrated into CFD simulations. Based on a design of experiments, and the hydrodynamics data recovered from simulations, response surfaces were built and a multiobjective optimization was achieved in order to determine the geometry minimizing the particle stress, and also by adhered cells. WJ-MSC cultures in minibioreactors equipped with impellers displaying various geometries were finally validated, with a preliminary comparison of the impact of these geometries on the cell expansion


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