Mécanismes d'action et de résistance des Adénovirus C au Brincidofovir

par Linda Feghoul

Thèse de doctorat en Sciences de la vie et de la santé. Virologie

Sous la direction de Jérôme Le Goff.

Soutenue le 13-11-2017

à Sorbonne Paris Cité , dans le cadre de École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris) , en partenariat avec Université Paris Diderot - Paris 7 (établissement de préparation) et de Génétique des Virus et Pathogénèse des Maladies Virales (Paris) (laboratoire) .

Le président du jury était Jean-Hugues Dalle.

Le jury était composé de Jérôme Le Goff, Jean-Hugues Dalle, Florence Morfin-Sherpa, Marie-Edith Lafon, Bernard Klonjkowski.

Les rapporteurs étaient Florence Morfin-Sherpa, Marie-Edith Lafon.


  • Résumé

    Les adénovirus humains (HAdV) sont responsables d’une importante morbidité et mortalité chez les patients receveurs de cellules souches hématopoïétiques (CSH), en particulier chez les enfants. Le brincidofovir (BCV) prodrogue du cidofovir est un analogue de la cytosine. Il inhibe l’activité de l’ADN polymérase (ADN pol) des HAdV par arrêt de l’élongation et compétition avec les nucléotides naturels. Les objectifs de ce travail sont d’étudier la diversité génétique de l’ADN pol des HAdV et de mettre en place des outils pour l’analyse de la sensibilité des HAdV C et de résistance aux BCV. Dans une première partie, nous avons réalisé le séquençage complet du gène ADN pol de 60 souches virales cliniques. Les résultats montrent une variabilité nucléotidique de 9,9% et peptidique de 8,7%, variable en fonction du type. La région la plus variable est la région NH2 terminale avec 44,2% des mutations d’acides aminés. Aucune des mutations décrites comme associées à la résistance au CDV ou au BCV n’a été détectée. L’analyse du polymorphisme a aussi montré que les séquences ADN pol permettent d’identifier les sources de transmission au cours d’une épidémie. Enfin nos observations suggèrent la faible probabilité d’évènements de recombinaison comme facteur d’évolution du gène codant pour l’ADN pol. Dans une seconde partie, nous avons développé une stratégie de génétique inverse à partir de deux plasmides, un codant pour le génome entier délété de l’ADN pol (Adv-deltaPol) et un codant uniquement pour l’ADN pol (Pol) (3 kilobase) dans lequel les mutations sont introduites par mutagénèse dirigée (Pol-muté). Après une étape de recombinaison bactérienne en un seul plasmide (Adv-deltaPol-Pol-muté), des cellules 293T sont transfectées afin de produire les virus recombinants. La susceptibilité au BCV des virus mutés sera analysée sur des cellules A549. Au total de 12 plasmides Pol-muté ont été produits, le virus recombinant L677F a été obtenu. Les productions des autres virus recombinants sont en cours.

  • Titre traduit

    Mechanism of Adenovirus C Resistance to Brincidofovir


  • Résumé

    Human adenoviruses (HAdV) are responsible for significant morbidity and mortality in hematopoietic stem cell (HSC) recipients, particularly in children.Brincidofovir (BCV) prodrug of cidofovir is an analogue of cytosine. It inhibits the DNA polymerase (DNA pol) activity of HAdV by stopping elongation and competition with natural nucleotides.The objectives of this work are to study the genetic diversity of the pol DNA of HAdV and to set up tools for the analysis of HAdV C sensitivity and resistance to BCV.In a first part, we carried out the complete sequencing of the DNA pol gene of 60 clinical viral strains. The results show a nucleotide variability of 9.9% and peptide variability of 8.7%, variable according to the type. The most variable region is the NH2 terminal region with 44.2% of the amino acid mutations. None of the mutations described as associated with CDV or BCV resistance were detected. Polymorphism analysis has also shown that DNA pol sequences can identify sources of transmission during an outbreak. Finally, our observations suggest the low probability of recombination events as a factor of evolution of the gene coding for the DNA pol. In a second part, we developed a reverse genetic strategy from two plasmids, one coding for the whole genome deleted from the DNA pol (Adv-deltaPol) and one coding only for the viral DNA pol (Pol). 3 kilobase) in which the mutations are introduced by site-directed mutagenesis (Pol-mutated). After a bacterial recombination step into a single plasmid (Adv-deltaPol-Pol-mutated), 293T cells are transfected to produce the recombinant viruses. BCV susceptibility of mutated viruses will be analyzed on A549 cells. A total of 12 Pol-mutated plasmids were produced, recombinant virus L677F was obtained. Production of other recombinant viruses is ongoing.


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