Développement de stratégies d'analyse miniaturisée de biomarqueurs de la polyneuropathie amyloïde familiale à transthyrétine

par Jeanne Bataille

Thèse de doctorat en Chimie

Sous la direction de Antoine Pallandre et de Isabelle Le Potier.

Le président du jury était Claire Smadja.

Le jury était composé de Antoine Pallandre, Claire Smadja, Anne Varenne, Karine Faure, Nicolas Auzeil, Antoine Pilon.

Les rapporteurs étaient Anne Varenne, Karine Faure.


  • Résumé

    La polyneuropathie amyloïde familiale à transthyrétine (FAP-TTR) est une maladie rare héréditaire à transmission autosomique dominante liée à la production de formes mutantes de la transthyrétine (TTR). Ces mutations sont à l’origine d’un changement de conformation de la protéine qui, in vivo, se présente sous forme de tétramère. Celui-ci est alors déstabilisé et évolue vers la formation de fibrilles amyloïdes qui s'accumulent au niveau du système nerveux autonome, des nerfs périphériques et des organes. Ces dépôts sont responsables de la pathologie. Dans le but d’évaluer l’efficacité des thérapies pouvant être mises en œuvre, nous avons développé des stratégies analytiques visant à concevoir un système « point of care » à usage hospitalier permettant de quantifier les formes mutante et native circulantes de la TTR. La méthodologie développée consiste à réaliser la séparation électrocinétique de fragments ciblés de la TTR, obtenus par digestion enzymatique de la protéine. Cette approche analytique a été développée en se focalisant sur une mutation fréquente en France : la TTR Thr49Ala où une thréonine est remplacée par une alanine en position 49. Au cours de cette thèse, deux types de microréacteurs enzymatiques ont été étudiés, i.e. (i) un lit fluidisé contenant des particules magnétiques fonctionnalisées par des molécules de trypsine et (ii) une puce monolithique à base de thiol-ène fonctionnalisée également par la trypsine. Le pouvoir catalytique de ces microsystèmes a été comparé en mesurant l’efficacité de digestion du BApNA (substrat modèle) et de la TTR à l’aide de méthodes analytiques telles que la spectrophotométrie d’absorption UV-Visible, l’électrophorèse capillaire couplée à une détection UV (EC-UV) et la chromatographie liquide couplée à la détection par spectrométrie de masse (UHPLC-SM). Les résultats obtenus ont montré que le microréacteur enzymatique monolithique à base de thiol-ène était le plus performant pour digérer la TTR. Par ailleurs, nous avons réalisé, au cours de cette étude, l’optimisation d’une méthode EC-UV, adaptée à l’analyse des digestats recueillis en sortie de microréacteur. Elle a permis de séparer et de quantifier les peptides d’intérêt pour déterminer le rapport de TTR mutante (Thr49Ala) sur TTR native.

  • Titre traduit

    Development of miniaturized analytical strategies for the analysis of biomarkers of familial transthyretin amyloid polyneuropathy


  • Résumé

    Transthyretin familial amyloid polyneuropathy (TTR-FAP) is a hereditary rare disease with an autosomal dominant transmission, related to the production of mutant forms of transthyretin (TTR). These mutations lead to a conformational change of the protein whose in vivo form is a tetramer. As a consequence, this tetramer is destabilized and evolves towards the formation of amyloid fibrils that aggregate on the autonomic nervous system, peripheral nerves, and organs. These deposits are responsible for the pathology. In order to evaluate the efficiency of possible therapies, we developed analytical strategies aiming at designing a “point of care” system for hospital use, which would enable the quantification of circulating mutant and native forms of TTR. The methodology that we developed consists in undertaking the electrokinetic separation of targeted TTR fragments obtained through the enzymatic digestion of the protein. This analytical approach has been developed while focusing on a frequent mutation in France: the TTR Thr49Ala mutation in which a threonine is substituted by an alanine in position 49. In this thesis, two types of enzymatic microreactors have been studied, i.e. (i) a fluidized bed containing magnetic particles functionalized by trypsin molecules and (ii) a thiol-ene-based monolithic chip also functionalized by trypsin. The catalytic power of these microsystems has been compared by measuring the digestion efficiency of BApNA (model substrate) and TTR through analytical methods such as UV-visible absorption spectrophotometry, capillary electrophoresis with UV detection (CE-UV), and liquid chromatography with mass spectrometry detection (UHPLC-MS). The results showed that the thiol-ene-based monolithic enzymatic microreactor was the most efficient system to digest TTR. Besides, during this study, we undertook the optimization of a CE-UV method which is adapted to the analysis of digested sample collected directly out of the microreactor. This allowed us to isolate and quantify the peptides of interest to measure the ratio of mutant TTR (Thr49Ala) versus the wild one.


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