Development of a functional screen for MreB mutants in Bacillus subtilis and characterization of a putative MreB effector

par Alba de San Eustaquio Campillo

Thèse de doctorat en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Arnaud Chastanet.

Le président du jury était Nicolas Bayan.

Le jury était composé de Arnaud Chastanet, Nicolas Bayan, Tâm Mignot, Anne Galinier, Nienke Buddelmeijer.

Les rapporteurs étaient Tâm Mignot, Anne Galinier.

  • Titre traduit

    Développement d'un crible fonctionnel de mutants de MreB chez Bacillus subtilis et caractérisation d'un effecteur putatif de MreB


  • Résumé

    L'acquisition et le maintien de la forme bactérienne ont été consciencieusement étudiés pendant une très longue période. Néanmoins, il reste encore beaucoup de questions sans réponse. Les bactéries Gram-positives présentent une couche externe rigide (la paroi cellulaire) qui permet de préserver la pression osmotique interne et la morphologie cellulaire. La paroi cellulaire (CW) est principalement formée par un maillage de polymères de sucres, le peptidoglycane (PG), sur lequel sont accrochés des acides téichoïques. L'absence de cette barrière essentielle provoque la perte de forme et, finalement, la lyse de la cellule. L’intégrité du CW est par conséquent d'une importance vitale pour les bactéries. La structure ainsi que la synthèse correcte du CW dépendent de supposées machineries d'élongation du peptidoglycane (PGEM) chargées d’assembler le réseau du PG. Le fonctionnement et la composition des PGEMs restent incertains, mais on sait qu’ils dépendent d’une protéine essentielle : MreB, une protéine procaryote similaire à l'actine. MreB est suspectée de contrôler l’activité et/ou l’assemblage des PGEMs, mais sa fonction exacte comme son mode de régulation sont actuellement inconnus. J’utilise Bacillus subtilis, le modèle des bactéries Gram-positives, pour mieux comprendre les fonctions de MreB via i- le développement et l’utilisation d’un criblage génétique pour l’identification de mutants de mreB non fonctionnels et ii- l'étude d'un effecteur potentiel de MreB.(i) MreB a été étudié pendant près de deux décennies et pourtant, sa (ses) fonction(s) reste(nt) mal comprise(s). Comme les approches biochimiques se sont révélées particulièrement difficiles jusqu'à présent, la plupart des études se sont concentrées sur la localisation cellulaire et la dynamique de la protéine. Au cours de mes travaux, j’ai conçu un criblage génétique au moyen duquel j’ai obtenu une collection de mutants de mreB fonctionnellement déficients, chez B. subtilis. La caractérisation de ces mutants a révélé de nombreux résidus importants pour le fonctionnement de la protéine. De façon intéressante, mes résultats indiquent que certains mutants ont conservé leurs propriétés dynamiques (suggérant une association fonctionnelle aux PGEMs) en plus d'une morphologie de type sauvage, tout en étant fortement affectés pour la croissance. Des résultats préliminaires indiquent que ces mutants sont compromis dans leur capacité à utiliser certaines sources de carbone, reliant MreB au métabolisme cellulaire. Ceci suggère l'existence soit d'un point de contrôle, soit d'un couplage entre le métabolisme du carbone et l'expansion du CW chez B. subtilis.(ii) Des résultats non publiés de notre groupe ont révélé l'existence d'un opéron non caractérisé (ydcFGH) dont l'expression est fortement induite en absence de MreB, par comparaison à la souche sauvage. J’ai 1- mis en évidence la cause probable de l’induction de cet opéron en l’absence de MreB, révélant ainsi l’existence de nombreuses mutations dans la souche MreB et 2- réalisé une caractérisation poussée de chaque gène de l'opéron ydcFGH. Bien que le lien exact entre MreB et ydcFGH soit encore inconnu, nos résultats suggèrent un rôle potentiel d’YdcH dans le contrôle du métabolisme du carbone et l'adaptation à la phase stationnaire. À la lumière de mes données issues du criblage génétique (i), ces résultats indiquent un lien fort entre MreB et le métabolisme du carbone.


  • Résumé

    Acquisition and maintenance of the bacterial shape has been conscientiously studied for a long time. Nevertheless, there are still many unanswered questions. Gram-positive bacteria present a rigid external coating (cell wall) that allows them to preserve internal osmotic pressure and cell morphology. The cell wall (CW) is mainly formed by the peptidoglycan meshwork (PG), that confers its structure to the CW, to which are connected teichoic acids. The absence of this essential barrier causes the loss of shape and, ultimately, lysis of the cells. Integrity of the CW is, therefore, a matter of vital importance for bacteria. Proper CW synthesis and structure depends on the so-called peptidoglycan elongation machineries (PGEM) in charge of building the PG meshwork. The precise composition and functioning of the PGEM is not completely understood but they rely on a key player: MreB, a conserved prokaryotic actin-like protein. MreB is suspected to control PGEM activity and/or assembly but its precise function and mode of regulation are currently unknown. I used Bacillus subtilis, the model for Gram-positive bacteria, to gain a better understanding of MreB functions via i- the development and use of a genetic screen for loss-of-function mutants of mreB and ii- the study of a potential effector of MreB.(i) MreB has been studied for almost two decades now and still, little is known about its function(s). Since biochemical approaches proved to be difficult so far, most of the studies have focused on cellular localization and dynamics of the protein. Here, I have designed a genetic screen by means of which I have obtained a collection of functionally impaired mreB mutants in B. subtilis. Characterization of these mutants revealed numerous key residues for the functioning of the protein. Interestingly, my results indicate that some mutants have kept their dynamic properties (suggesting functional association to the PGEM) together with a wild type shape, while being strongly affected for growth. Preliminary results indicate an impaired ability to use certain carbon sources linking MreB to cellular metabolism. This suggests the existence of either a checkpoint or a coupling between carbon metabolism and CW expansion in B. subtilis.(ii) Unpublished results from our group revealed the existence of an uncharacterized operon (ydcFGH), whose expression is highly induced in the absence of MreB by comparison to the wild type. I have 1- deciphered the cause of ydcFGH induction in the absence of MreB, revealing the existence of multiple mutations in the MreB strain and 2- realized a thorough characterization of each gene of the ydcFGH operon. Although the exact link between MreB and ydcFGH is yet unknown, my results suggest a potential role of YdcH in the control of carbon metabolism and adaptation to stationary phase. In light of my mutagenesis screen data (i), these results are pointing towards a strong link between MreB and carbon metabolism.


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