Etude des erreurs programmées du ribosome par microscopie de fluorescence en molécule unique

par Nathalie Barbier

Thèse de doctorat en Physique

Sous la direction de Karen Perronet et de Olivier Namy.

Soutenue le 17-10-2017

à Paris Saclay , dans le cadre de École doctorale Ondes et Matière (2015-.... ; Orsay, Essonne) , en partenariat avec Institut d'optique théorique et appliquée (Orsay, Essonne) (?tablissement op?rateur d'inscription) et de Laboratoire Charles Fabry / Biophotonique (laboratoire) .

Le président du jury était Marie-Claire Schanne-Klein.

Le jury était composé de Karen Perronet, Olivier Namy, Jean-Jacques Diaz.

Les rapporteurs étaient Sébastien Huet, Alexandra Fragola.


  • Résumé

    La synthèse des protéines est un mécanisme central de la vie cellulaire dont la compréhension est un enjeu pour la recherche biomédicale. Des phénomènes comme les erreurs programmées de la traduction eucaryote ou l’initiation par des structures IRES virales sont impliqués dans les processus de réplication de virus et de bactéries. Mieux appréhender ces processus est une étape essentielle pour aboutir au développement d’approches thérapeutiques innovantes. Les études en molécule unique permettent d’observer chaque système réactionnel individuellement et donnent accès à des évènements asynchrones difficilement observables en mesure d’ensemble, tels la traduction de protéines. Ce manuscrit de thèse présente une approche d’étude de la traduction par un ribosome eucaryote (mammifère) en molécule unique. Nous observons les systèmes traductionnels grâce à des marqueurs fluorescents liés à des oligonucléotides pouvant s’hybrider sur les séquences d’ARN messagers traduites. L’observation de ces marqueurs est faite par microscopie de fluorescence en réflexion totale (TIRFM), les ARNm étant accrochés à la surface de l’échantillon. En lisant l’ARNm, le ribosome détache les marqueurs, et leurs instants de départ nous permettent de remonter à la dynamique de traduction de ribosomes individuels. Cette méthode permet d’obtenir des données cinétiques statistiques sur un grand nombre de systèmes traductionnels en parallèle pouvant alors être ajustées par des lois de probabilité. Partant de ce principe, mes travaux de thèse ont eu pour objectif d’étendre nos expériences à une nouvelle problématique biologique : l’étude des évènements non canoniques de la traduction eucaryote. Pour cela nous avons apporté les modifications et les optimisations nécessaires au dispositif et au protocole expérimental pour l’adapter à ces nouveaux enjeux. Nos mesures de la cinétique in vitro de l’élongation eucaryote ont mis à jour un délai dû à une initiation non-canonique. En effet, nous réalisons le recrutement du ribosome par l’ARNm grâce à une structure virale de type IRES. Dans nos conditions d’expérience, l’incorporation d’un acide aminé prend environ une seconde tandis que cette structure induit un retard à la traduction de plusieurs dizaines de secondes. Nous avons réalisé une étude comparative de plusieurs de ces structures virales et avons montré que le délai mesuré était une caractéristique conservée dans le cadre de l’initiation non canonique. Ce résultat ouvre des perspectives d’études cinétiques tant pour approfondir nos conclusions sur les IRES que pour aborder d’autres évènements non canoniques tel que le décalage de la phase de lecture ou le franchissement du codon stop.

  • Titre traduit

    kinetic study of recoding events in eucaryotic translation by single molecule fluorescence microscopy


  • Résumé

    The synthesis of proteins is a central mechanism of cellular life whose understandingis an issue for biomedical research. Phenomena such as programmed errors of eukaryotic translation orinitiation by viral IRES structures are involved in virus and bacterial replication processes. A Betterunderstanding of these processes is an essential step towards the development of innovative therapeuticapproaches.Single molecule studies allow each reaction system to be observed individually and give accessto asynchronous events, such as protein translation, that are difficult to observe in overall measurements.This phD manuscript presents a single molecule approach to study translation by a eukaryotic(mammalian) ribosome.We observe the translational systems thanks to fluorescent primers linked to oligonucleotides thatare hybridized to the translated mRNA sequences. These markers are observed by Total InternalReflection Fuorescence Microscopy (TIRFM) ; with the mRNAs attached to the sample surface. Whilereading the mRNA, the ribosome detaches the primers, and their instants of departure give us access tothe translation dynamics of individual ribosomes. This method makes it possible to obtain statisticalkinetic data on a large number of parallel translational systems, which can then be fitted by probabilitylaws. On the basis of this principle, my phD work aimed at extending our experiments to a newbiological issue : the study of non-canonical events in eukaryotic translation. To this end, we havemade the modifications and optimizations necessary for the set-up and the experimental protocol toadapt them to these new challenges.Our measurements of the in vitro kinetics of eukaryotic elongation have revealed a delay due tonon-canonical initiation. Indeed, the ribosome are recruited on the mRNA thanks to a viral, IREStype structure. Under our experimental conditions, the incorporation of an amino acid takes aboutone second while this structure induces a translation delay of several tens of seconds. We carried outa comparative study of several of these viral structures and showed that the measured delay was acharacteristic preserved in the framework of the non-canonical initiation. This result opens up prospectsfor kinetic studies both to deepen our conclusions on IRES and to address other non-canonical eventssuch as programmed frameshifting or STOP codon readthrough.


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