Cassava Bacterial Blight : development of a performant molecular detection tool and diversity analysis of Xanthomonas axonopodis pv. manihotis populations in Venezuela

par Carolina Flores

Thèse de doctorat en Evolution des systèmes infectieux

Sous la direction de Valérie Verdier et de Boris Szurek.

Le président du jury était Claire Neema.

Le jury était composé de Valérie Verdier, Boris Szurek, Claire Neema, Silvia Restrepo, Claude Bragard, Ousmane Koita.

Les rapporteurs étaient Silvia Restrepo, Claude Bragard.

  • Titre traduit

    La bactériose vasculaire du manioc : mise au point d'un outil de détection moléculaire performant et analyse de la diversité des populations de Xanthomonas axonopodis pv. manihotis populations au Venezuela


  • Résumé

    Le manioc (Manihot esculenta L. Crantz) est cultivé dans toute la zone intertropicale. Compte tenu de ses utilisations potentielles, le développement de la culture du manioc a considérablement augmenté au niveau mondial, mais il est encore considéré comme une culture de subsistance en particulier dans les régions pauvres où il est cultivé par les petits producteurs. La production du manioc est fortement contrainte par des facteurs biotiques et abiotiques, dont la bactériose vasculaire du manioc (CBB) et la nécrose bactérienne du manioc (CBN) qui sont deux maladies causées par les bactéries Xanthomonas axonopodis pv. les manihotis (Xam) et X. cassavae (Xc), respectivement. CBB est considérée comme la principale maladie bactérienne, notamment au Venezuela où la CBB a été signalée pour la première fois dans les années 70. Dans les années 90, des études ont été menées pour élucider la variabilité génétique de Xam dans différentes régions du pays, au moyen d’outils moléculaires, mettant en évidence un degré élevé de polymorphisme parmi les souches analysés.Le sujet de cette thèse porte sur la situation de CBB au Venezuela 20 ans après. Quelle est la diversité génétique actuelle de Xam au Venezuela? Quelle est la structure génétique des populations de Xam dans ce pays, et comment diffèrent-elles des souches de Xam recueillies dans les années 90? En outre, étant donné que Xam et Xc provoquent des symptômes semblables sur feuilles de manioc et présentent des caractéristiques physiologiques et morphologiques similaires, nous avons également visé à développer un nouvel outil de diagnostic moléculaire permettant une détection rapide et fiable de Xam et de Xc tout étant capable de les discriminer l’une vis à vis de l’autre.Pour atteindre nos objectifs, nous avons d'abord établi une PCR-duplex comme outil de détection moléculaire des xanthomonades infectant le manioc. Sur la base de l'analyse in silico des séquences du génome de 66 souches de Xam et une de Xc, nous avons pu sélectionner 6 paires d'amorces candidates spécifiques de Xam et six autres pour Xc. Nous avons pu développer un test de PCR-duplex qui a été validé en testant 53 souches de Xam et 25 souches de Xc issues de différents pays, 18 souches non cibles contrôles et cinq souches épiphytes associées au manioc. Cette technique représente un outil utile pour détecter et différencier Xam et Xc provenant de cultures in vitro mais aussi fonctionnelle à partir de tissues de plantes infectés.Deuxièmement, nous avons donc évalué la diversité des populations de Xam à l’aide de l’étude de microsatellites (ou MLVA pour « Multiple loci VNTR analysis »). Une enquête de terrain menée dans six États du Venezuela a permis d'évaluer la présence de la maladie, son statut et nous a permis d'établir une collection de souches de Xam dont l’analyse détaillée de la diversité a pu être réalisée. Au total nous avons isolé 202 souches de Xam issues de six localités situées dans quatre états. À l'aide d'un schéma 14-MVLA, nous avons analysé 12 populations et mis en évidence un indice élevé de la diversité génétique au sein de ces populations et entre elles, et principalement dans l'est du pays.Le développement de ce type de recherche est essentiel pour une gestion raisonnée des cultures dans le monde. Conjugué aux politiques agricoles existantes, il nous permettra de mieux comprendre les agents pathogènes d'importance agricole et les mécanismes impliqués dans leur établissement dans le temps et à travers l’espace. L'objectif à long terme est d'appliquer des mesures de contrôle efficaces et durables, ce qui conduira à des mesures de quarantaine plus efficaces pour prévenir la propagation de la maladie.


  • Résumé

    Cassava (Manihot esculenta L. Crantz) belongs to the group of roots and tubers and is cultivated in the tropics worldwide. This species is a nutritional alternative in many populations where no optimal crop production, general conditions nor technological support exist. Considering its potential uses, the global development of cassava crop has increased significantly but it is still considered a subsistence crop in poor regions lead by smallholder producers. Cassava is affected by biotic and abiotic factors during its life cycle, which heavily limiting its optimal performance. A variety of pests and diseases are known to affect cassava production. Among them are those caused by Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam) and Xanthomonas cassavae (Xc), causal agents of Cassava Bacterial Blight (CBB) and Cassava Bacterial Necrosis (CBN) diseases, respectively. CBB is considered the major bacterial disease that affects cassava crop worldwide which is also the case in Venezuela where it was first reported in the 70s. Since the 90s, studies were conducted to elucidate Xam genetic variability in different regions in the country, by means of different molecular tools available at that time. A high degree of polymorphism among the isolates was reported, whether collected from the same or different fields. The Xam population was distributed into eight clusters and no correlation was observed between genetic diversity and geographic origin.Our questions deal with the situation of CBB in Venezuela 20 years later : what is the current genetic diversity of Xam populations in Venezuela? what is the genetic structure of Xam populations and how do they differ with respect to Xam strains collected in 90s. Moreover, because Xam and Xc cause similar symptoms on cassava leaves and display similar physiological and morphological characteristics, we also aimed at developing a new molecular diagnostic tool allowing for fast and reliable detection of Xam and able to discriminate with Xc.To achieve our goals, we first established a duplex-PCR as a molecular detection tool of cassava-infecting xanthomonads. Based on in silico analysis of the genome sequences of 66 Xam and 1 Xc strains, we were able to select 6 Xam and 6 Xc primers pairs candidates, of which one set of primers for each was selected for further studies. We were able to develop a duplex-PCR assay that was validated upon testing 53 Xam strains and 25 Xc strains from different countries, 18 non-target strains, and 5 epiphytic strains associated to cassava, proving this technique a useful tool to detect and differentiate Xam and Xc from in vitro cultures and in planta.Secondly we assessed the diversity of Xam populations through a variable number of tandem repeat analysis (MLVA). A field survey conducted in six states in Venezuela enabled to evaluate the occurence of the disease, its status and allowed us to establish a strain collection for detailed diversity analysis. We isolated 202 Xam strains from six localities, localized in four states. Using a MVLA14-scheme, we analyzed 12 populations highlighting a high index of genetic diversity among and within populations, mainly in the east of the country.The development of this type of research is essential in the management of crops in the world and coupled with the existing agricultural policies, it will allow us to have a deeper understanding of pathogens of agricultural importance and the mechanisms involved in their establishment over time and across regions. The long-term objective of this is to apply control measures that are effective in time, thus establishing more stringent quarantine measures to prevent the spread of the disease.

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