Approche multi-échelle pour l’étude de la réaction de N-acylation enzymatique d’acides aminés

par Léna Dettori

Thèse de doctorat en Génie des procédés et des produits

Sous la direction de Isabelle Chevalot et de Yann Guiavarc'h.

Le président du jury était Eric Dubreucq.

Le jury était composé de Isabelle André, Catherine Sarazin, Catherine Humeau-Virot, Stéphane Delaunay, Jérôme Guilbot.

Les rapporteurs étaient Isabelle André, Catherine Sarazin.


  • Résumé

    Approche multi-échelle pour l’étude de la réaction de N-acylation enzymatique d’acides aminés La réaction de N-acylation d’acides aminés ou de peptides permet l’obtention de dérivés de ces molécules présentant des propriétés bioactives et/ou techno-fonctionnelles, avec une biodisponibilité, une hydrophobie et une stabilité accrue. Les acides aminés acylés ont été largement décrits comme constituant une classe d'agents tensioactifs avec d'excellentes propriétés de surface, des activités biologiques intéressantes, un faible potentiel de toxicité et un faible impact environnemental. Actuellement réalisée de manière chimique à l’échelle industrielle, l’acylation de ces acides aminés ou peptides présente des contraintes en termes de sélectivité réactionnelle et d’innocuité vis-à-vis de l’environnement ainsi qu’en termes de coût de retraitement des effluents polluants. Une alternative à cette voie chimique est l’utilisation d’enzymes capables de catalyser ces réactions d’acylation. Dans la littérature, différents couples d’enzymes et de solvants ont déjà été décrits. Néanmoins, les performances réactionnelles de ces systèmes demeurent parfois limitées. L’objectif de cette thèse a donc été l’amélioration du procédé d’acylation par une approche à différentes échelles. À l’échelle moléculaire, une étude a été réalisée avec la lipase B de Candida antarctica (CALB). Une approche de modélisation moléculaire a été utilisée afin de mettre au point une méthodologie associant des simulations de docking et des calculs d’interaction permettant d’améliorer la compréhension et permettre la prédiction de la régiosélectivité de CALB lors de l’acylation de la lysine par différents acides gras. Des études ont également été conduites à l’échelle réactionnelle, notamment avec la recherche de nouveaux biocatalyseurs de type aminoacylases dans l’extrait brut de Streptomyces ambofaciens. La régiosélectivité et les performances de la réaction catalysée par ces enzymes ont été comparés à celles de CALB. Les résultats ont mis en évidence un potentiel très prometteur des aminoacylases de S. ambofaciens concernant la synthèse d’acide aminés/peptides acylés. En effet, en plus de leur aptitude à réaliser la réaction d’acylation en milieu aqueux, ces enzymes possèdent une régio-sélectivité qui diffère de celle de CALB. Cette régio-sélectivité orientée vers les groupements N-terminaux est un atout très peu décrit à ce jour, car elle permet d’acyler ces molécules sans modifier les chaînes latérales des acides aminés ou des peptides et donc leurs fonctionnalités. Dans la dernière partie de ces travaux, des études à l’échelle procédé ont été menées. Tout d’abord, l’immobilisation des aminoacylases sur des matériaux mésoporeux silicatés a été réalisée et différentes méthodes d’immobilisation ont pu être comparées. Cette étude a permis de proposer une méthode d’immobilisation des aminoacylases de S. ambofaciens par physisorption, permettant de conserver l’activité spécifique pendant au moins 3 cycles. Puis, dans une dernière partie, l’intensification de la réaction d’acylation en réacteur micro-ondes ou microstructurés a été abordée. Les expérimentations réalisées dans un réacteur chauffé par irradiation micro-onde ont montré que ce type de réacteur était adapté à la réaction d’acylation catalysé par CALB sous sa forme immobilisée commerciale (Novozym435®) en solvant organique, ce qui n’est pas le cas avec des aminoacylases de S. ambofaciens libres, en milieux aqueux. Pour cette réaction, d’autres méthodes d’intensification ont été envisagées, notamment en réacteur microstructuré de type microfluidique. L’efficacité du mélange étant primordiale notamment en milieu biphasique, celle-ci a pu être améliorée avec un taux de conversion supérieur dans ce réacteur comparativement à un réacteur classique agité mécaniquement

  • Titre traduit

    Multi-scale approach for the study of enzymatic N-acylation reaction of amino acids


  • Résumé

    N-acylation of amino acids or peptides results in bioactive and/or functional molecules showing increased bioavailability, hydrophobicity and stability. Acylated amino acids have been broadly described as being a kind of surfactant with great surface chemistry properties, interesting biological activities, weak toxicity and low environmental impact. Acylation of amino acids or peptides is being performed chemically at industrial scale. It creates constraints in term of reaction selectivity, environmental safety and cost of polluted wastewater treatment. Enzymatic catalysis is an alternative to chemical acylation reaction. Several enzyme/solvent pairs have already been described in the literature. Their performance are however somewhat limited. The objective of this thesis work was thus to improve the capacity of acylation processes at different scales. At the molecular scale, a study was performed using Candida antarctica’s (CALB) lipase B. Molecular modeling was used to create a methodology coupling docking simulation and interaction calculus that would allow for a better understanding of CALB regioselectivity during lysine acylation by different fatty acids. Studies were also conducted at the reaction level, especially by searching for new aminoacylase-type of biocatalysts in Streptomyces ambofaciens raw extract. Regioselectivity and performance of these enzyme’s catalytic reactions were compared to those of CALB. Results brought into light a promising potential from S. ambofaciens’ aminoacylases in synthesizing acylated amino acids/peptides. Indeed, on top of their ability to catalyse acylation reaction in aqueous solution, these enzymes have a different regioselectivity compared to CALB’s. Regioselectivity targeting N-terminal groups is a rarely researched phenomenon allowing acylation to be performed without modifying amino acids or peptides lateral chains and hence their functionality. In the last part part of this work, studies at process scale were performed. Aminoacylase were first immobilized on mesoporous silicates and several immobilisation methods were compared. Using physisorption, a method for the immobilisation of S. ambofaciens’ aminoacylases was developed to reach a conserved specific activity during 3 cycles. Finally, intensification of acylation reaction was examined in microwave or microstructured reactors. First, an experimental set up was performed in an heated reactor using microwaves irradiation. This kind of reactor was demonstrated as being adapted to acylation reaction using a commercial immobilized form of CALB (Novozym435®) as catalyst in organic solvent. The microwave reactor was however not suited for free S. ambofaciens aminoacylase in aqueous solution. For that latter reaction, intensification had to be approached through other aspects of the process. Hydrodynamic appeared indeed as an important aspect for this reaction occurring in a biphasic medium composed of fatty acids and aqueous solution. A microstructured microfluidic reactor was hence tested. Conversion yield were increased with this system. This study demonstrated how mixing quality was an important factor for acylation reaction and could be a way to intensify the enzymatic process at larger scale


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