Les venins animaux comme outils de recherche et d'identification de nouveaux composés thérapeutiques

par Sawsan Al Khoury

Thèse de doctorat en Neurosciences - Neurobiologie

Sous la direction de Michel De waard.

Soutenue le 07-07-2017

à Grenoble Alpes , dans le cadre de École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble) , en partenariat avec Institut des neurosciences de Grenoble (laboratoire) et de INSERM UMR 1087 - CNRS UMR 6291 (Nantes) (laboratoire) .

Le président du jury était Catherine Ghezzi.

Le jury était composé de Christophe Arnoult.

Les rapporteurs étaient Hervé Darbon, Emmanuel Bourinet.


  • Résumé

    Les venins issus d’animaux sont des mélanges complexes de substances toxiques ou non qui sont utilisées pour se défendre contre des prédateurs et/ou pour chasser. Le venin est une solution contenant de nombreux composés avec une part prédominante pour les protéines et les peptides. Le venin d’un seul animal peut contenir plusieurs centaines de substances différentes. Les peptides dérivés du venin peuvent cibler des récepteurs membranaires et des canaux ioniques avec une grande affinité et une haute spécificité. Les animaux venimeux les plus connus sont les serpents, les scorpions et les araignées, et leurs toxines sont largement utilisés dans la recherche comme outils moléculaires et pour le développement des nouveaux traitements. Par conséquent, les venins d’animaux sont des sources naturelles extrêmement riches de découverte de molécules biologiquement actives. Dans ces études, nous avons criblé le venin du serpent égyptien Walterinnesia aegyptia pour l’identification de novo de peptides capables d’activer la motilité des spermatozoïdes in vitro des souris OF1. La Spermatin et X sont deux peptides de 57 et 63 acides aminés respectivement, isolés du venin du Walterinnesia aegyptia par la technique de séparation RP-HPLC suivie par la chromatographie échangeuse de cations. La spermatin et l’actiflagelin sont deux activateurs de la motilité spermatique des souris OF1. La spermatin a été séquencé par séquençage de novo en utilisant i) la digestion des peptides par des enzymes protéases comme la trypsine, la chymotrypsine et la protéase V8, et ii) les techniques de spectrométrie de masse TOF/TOF MS/MS et LC-ESI-QTOF MS/MS. Par contre, c’est la complémentarité entre le séquençage de novo, la dégradation d’Edman et les analyses ESI MS/MS qui a permis l’identification de la séquence de l’actiflagelin. Il semble dès lors que la spermatin et l’actiflagelin peuvent être utilisés comme outils pharmacologiques pour diminuer le taux d’infertilité. De l’autre côté, la maurocalcine (MCa) est un peptide de 33 résidus issu du venin du scorpion tunisien Scorpio maurus palmatus. La MCa est un activateur des récepteurs de ryanodine (RyR1) des muscles squelettiques. Elle stimule fortement la liaison du [³H]-ryanodine aux RyR1 et assure le relâchement du calcium intracellulaire des vésicules du réticulum sarcoplasmique (RS). Différents mutants de la MCa ont été utilisés et les résultats montrent que l’Arg24 joue un rôle critique dans la liaison de la MCa aux RyR1 ou tout au moins dans son impact fonctionnel. D’autres mutations de la MCa sont capables de modifier la liaison du [³H]-ryanodine aux RyR1 mais avec une plus faible efficacité que la séquence sauvage. De plus, la MCa est capable de franchir la membrane plasmique et elle est considérée comme un peptide de pénétration cellulaire. Ici, nous avons montré que la MCa est un substrat de la protéine kinase A in vitro suite à la phosphorylation du résidu Thr26. Nous avons aussi démontré que la MCa P-Thr26 inverse l’effet de la MCa. La MCa P-Thr26 inhibe la liaison du [³H]-ryanodine aux RyR1 des muscles squelettiques du lapin et elle est incapable de favoriser la libération du calcium des vésicules du RS. Alors, la MCa peut être utilisée pour le développement des analogues résistants à la phosphatase. Par ailleurs, nous avons étudié l’effet de l’agent réducteur dithiothreitol ou les agents oxydants le diamide et le peroxyde d’hydrogène sur la stimulation du RyR1 par la MCa ou MC E12A. La maurocalcine améliore la liaison du [³H]-ryanodine aux RyR1 des vésicules seules ou pré-incubées avec le dithiothreitol ou les agents oxydants. L’interprétation des résultats indiquent que la MCa et son mutant sont plus efficaces à activer RyR1 sous des conditions de réduction. Par ailleurs, des résultats ont montré que MCa E12A réduit significativement l’inhibition de la liaison du [³H]-ryanodine aux RyR1 induite par Mg²⁺.

  • Titre traduit

    venoms animals as research tools and identification of new therapeutic compounds.


  • Résumé

    Animal venoms are complex mixtures of toxic substances that are used to defend themselves against predators and / or to hunt. Venom is a solution containing many compounds, especially proteins and peptides. The venom of a single animal may contain several hundred different substances. Peptides derived from venom can target membrane receptors and ion channels with strong affinity and high specificity. The best known venomous animals are snakes, scorpions and spiders, and their toxins are widely used in research as molecular tools and for the development of new treatments. Therefore, animal venoms are an extremely rich and complex source of biologically active molecules. In these studies, we screened the venom of the Egyptian snake Walterinnesia aegyptia for the discovery of peptides able to activate sperm motility in vitro of mice OF1. Spermatin and actiflagelin are two peptides of 57 and 63 amino acids, respectively, isolated from the venom of Walterinnesia aegyptia by the RP-HPLC separation technique followed by cation exchange chromatography. Spermatin and actiflagelin are two activators of the spermatic motility of OF1 mice. Spermatin was sequenced by de novo sequencing using digestion of enzymes proteases such as trypsin, chymotrypsin and V8 protease, and further TOF / TOF MS / MS and LC-ESI-QTOF MS / MS. While the complementarity between de novo sequencing, Edman degradation and ESI MS / MS analyzes allowed the identification of the sequence of actiflagelin. Then, Spermatin and actiflagelin can be used as pharmacological tools to decrease the rate of infertility. On the other hand, maurocalcin (MCa) is a 33-residue peptide derived from the venom of the scorpion Scorpio maurus palmatus. MCa is an activator of ryanodine receptors (RyR1) of skeletal muscles. It strongly stimulates the binding of [³H]-ryanodine to RyR1 and ensures the release of intracellular calcium from the vesicles of the sarcoplasmic reticulum (SR). Different MCa mutants were used and the results showed that Arg24 plays a critical role in the binding of MCa to RyR1. Other mutations were able to alter the binding of [³H]-rhyanodine to RyR1 but with low efficiency. In addition, MCa is able to cross the plasma membrane and is considered a cell-penetrating peptide. Here, we have shown that MCa is a substrate of PKA in vitro following the phosphorylation of Thr26. We have also demonstrated that MCa P-Thr26 reverses the effect of MCa. MCa P-Thr26 inhibits the binding of [³H]-ryanodine to RyR1 from the rabbit skeletal muscle, and is unable to promote the release of calcium from the SR vesicles. Then, MCa can be used for the development of phosphatase resistant analogs.Keywords: Animal venom, Walterinnesia aegyptia, RP-HPLC, ion exchange chromatography, de novo sequencing, Spermatin, X, maurocalcine (MCa), [³H]-ryanodine, ryanodine receptors (RyR1), calcium, phosphorylation, sarcoplasmic reticulum (SR).

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