Tat-independent lentivirus genomes for vaccination and host/pathogen interaction studies

par Deepanwita Bose

Thèse de doctorat en Virologie - Microbiologie - Immunologie

Sous la direction de Yahia Chebloune.

Soutenue le 26-01-2017

à l'Université Grenoble Alpes (ComUE) , dans le cadre de École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble) , en partenariat avec Pathogénèse et vaccination lentivirales (Grenoble) (laboratoire) et de Laboratoire de Pathogénèse et Vaccination Lentivirales (laboratoire) .

Le président du jury était Philippe Sabatier.

Le jury était composé de Corinne Ronfort.

Les rapporteurs étaient François Villinger, Guiseppe Bertoni.

  • Titre traduit

    Génomes de lentivirus Tat indépendants pour des études de vaccination et les interactions hôte/pathogène


  • Résumé

    Notre laboratoire a développé un prototype de vaccin unique contre le VIH-1 / SIDA. C'est un un lentivecteur ADN non-intégratif qui a été testé dans une étude pilote utilisant des modèles animaux. L'étude a montré la protection de tous les macaques (6/6) vaccinés et la réponse était composée de cellules effectrices (EM) et des cellules T mémoire centrale (CM). Plus important encore, elle contenait également des cellules antigène spécifique à haute capacité de prolifération contenant des cellules T mémoire de type cellule souche (TSCM). Durant le travail de cette thèse, le génome vaccinal a été encore amélioré en commutant son enveloppe dotée de tropisme CXCR4 contre des enveloppes à tropisme CCR5 de virus de clade B (WARO) obtenu à partir d'un patient infecté de façon chronique et de trois souches de VIH-1 de Clade C transmetteur foundateur (T/F) de patients Zambiens. Une deuxième amélioration du vaccin a été réalisée en modifiant le génome afin qu’il puisse incorporer des adjuvants moléculaires capables d'améliorer d’avantage son immunogénicité.Etant donné que le lentivirus humain VIH-1 a développé plusieurs stratégies complexes pour persister, l’autre partie de la thèse a été consacrée à développer un outil pour comprendre la latence dans les cellules T CD4 + de la mémoire infectée. Les cellules latentes ont des génomes d'ADN viral intégrés non exprimés. Un des principaux mécanismes de cette latence est l'absence de transactivation du promoteur LTR par Tat. Les développements récents de la thérapie antivirale hautement active (HAART) efficace pour contrôler les cellules infectées circulantes et dans les tissus reste inefficaces contre les cellules du réservoir composé de cellules infectées latentes. Un des obstacles pour ce type d'études est l'absence de prototypes de lentivirus de primates appropriés incapables de d’effectuer la latence pour s’en servir comme modèle d'infection extrême dans l'évaluation. Nous avons émis l'hypothèse qu'un génome SHIV réplicatifdont l’expression est sous le contrôle de LTR du CAEV, Tat-indépendant doté de promoteur constitutif constituera un outil précieux pour de telles études. Nous avons conçu des LTRs chimères de CAEV portant les séquences d'attachement de celles du SIV à leurs extrémités et nous les ont utilisés pour contrôler l’expression du génome complet de SHIV-KU2. La construction résultante est SHIV-YCC qui devrait générer un virus qui ne n’effectue pas de latence en absence de Tat. Nous avons observé que les cellules transfectées avec le génome SHIV-YCC produisent des protéines SHIV qui s’assemblent en particules infectieuses excrétées des cellules. Les virions sont capables d'infecter les lymphocytes T CD4 + cibles tant dans les PBMC primaires que dans les lignées cellulaires. Le passage en série du virus dans les PBMC de macaques augmente la réplication et l'infectiosité du virus. SHIV-YCC est le premier lentivirus chimérique réplicatif de primates qui exprime de manière constitutive toutes les protéines virales. Ce nouveau modèle offre la possibilité d'étudier les événements précoces par lesquels le provirus subit une latence, en particulier lorsque le gène de l'enveloppe sera remplacé par celui du T / F CCR5 tropique VIH-1.


  • Résumé

    Our lab has previously described the generation of a unique vaccine prototype against HIV-1/AIDS. It is a non-integrative DNA lentivector vaccine tested in pilot studies in animal models of HIV vaccine. The non-human primate study showed protection of all 6/6 macaques and immune response correlates were composed of a variety of effector (EM) and central memory (CM) T cells. More importantly, they also contained high proliferating antigen specific cells containing a type of stem cell-like memory T cells (TSCM). In this thesis the vaccine was enhanced further by switching the CXCR4 envelope of the vaccine to CCR5 tropic envelopes such as the clade B WARO obtained from a chronically infected patient and a series of three transmitted/founder (T/F) HIV Clade C strains from Zambia. To improve further the vaccine we developed new strategies to incorporate molecular adjuvants able to enhance and sustain the newly elicited immune responses.Since the human lentivirus HIV-1 has developed multiple complex strategies to persist, the focus of the next part of my thesis was to develop a tool to ease and better understand the underlying mechanisms of latency in infected memory CD4+ T cells. Latently-infected cells have non-expressed integrated viral DNA genomes. One of the main mechanisms of this latency is absence of Tat transactivation of the LTR promoter. The recent focus post development of efficient highly active antiviral therapy (HAART), is the cure of the reservoir of latently infected cells. One of the obstacles for this type of studies is the lack of proper primate lentivirus prototypes incapable of undergoing latency as extreme infection model in the evaluation. We hypothesized that a replication-competent SHIV genome driven by the Tat-independent constitutive-expression LTRs of CAEV will be a valuable tool for such studies. We designed chimeric CAEV LTRs bearing the attachment sequences of SIV at their extremities and used them to drive the complete genome of SHIV-KU2. The resulting construct is SHIV-YCC which is expected to generate virus that will not undergo latency due to absence of Tat. We found that cells transfected with SHIV-YCC genome produce SHIV proteins that are assembled into infectious particles released out of the cells. Virions are able to infect target CD4+ T cells both in primary PBMCs and cell lines. Passaged virus in macaques PBMCs increased virus replication and infectivity. SHIV-YCC is the first chimeric primate replication-competent lentivirus that constitutively expresses all viral proteins. This new model offers the possibility of studying the early events by which provirus undergoes latency particularly when the envelop gene will be replaced with that of the T/F CCR5 tropic HIV-1.


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