Étude des voies de régulation de la méthylation de l’ADN et du relâchement du silencing après choc thermique chez Arabidopsis thaliana

par Maxime Auzon-Cape

Thèse de doctorat en Physiologie et Génétique Moléculaire

Sous la direction de Olivier Mathieu.

Le président du jury était Maria-Eugenia Gallego.

Le jury était composé de Emilie Brasset.

Les rapporteurs étaient Fredy Barneche, Jean Molinier, Cécile Raynaud.


  • Résumé

    Chez Arabidopsis thaliana, le silencing transcriptionnel est associé notamment aux modifications post-traductionnelles des queues des histones et à la méthylation des cytosines en contexte CG, CHG et CHH (où H peut être indifféremment T, A ou C). Plusieurs voies indépendantes conduisent à la méthylation de l’ADN en tout contexte via les méthyltransférases. A contrario, ROS1, une ADN déméthylase, « élague » les profils de méthylation et prévient ainsi d’une hyperméthylation du génome. Or, de façon intéressante, plusieurs mutants impliqués dans les voies de méthylation de l’ADN voient l’expression du gène ROS1 diminuer, ce qui trahit l’existence d’une boucle de rétrocontrôle négative entre les voies de méthylation et de déméthylation de l’ADN. Nous avons donc réalisé un crible génétique afin d’identifier un régulateur de l’expression de ROS1. Pour cela, nous avons utilisé une lignée pROS1:GUS constituée du gène rapporteur de la glucuronidase sous contrôle du promoteur de ROS1. Dans le fond mutant nrpd1a-4, le gène de ROS1 et de la glucuronidase sont sous-exprimés. Le crible consiste alors à identifier un mutant qui relâche l’expression de la glucuronidase et de ROS1 dans le fond mutant nrpd1a-4. Six mutants présentent une expression de la glucuronidase plus forte que le témoin pROS1:GUS dans le fond nrpd1a-4. Cependant, contrairement à ce qui était attendu, l’expression de ROS1 endogène est plus basse encore que chez pROS1:GUS dans le fond nrpd1a-4.Face à ses résultats, nous avons alors réorienté la thèse vers l’étude d’une voie de contournement du silencing des éléments répétés. En effet, lorsque l’on applique un stress thermique de 37°C durant 24h, l’on observe un relâchement du silencing de ces derniers. Toutefois, aucune modification épigénétique connue ne semble être impliquée. Pour étudier ce phénomène, nous disposons d’une lignée L5 qui, dans des conditions normales de culture, voit son transgène soumis aux mécanismes de silencing. Parce que la construction L5 comprend plusieurs répétitions de la glucuronidase sous contrôle du promoteur 35S, elle est alors assimilée à n’importe quel autre élément répété et, à ce titre, se retrouve être également exprimée après stress thermique. L’équipe a alors réalisé un crible sur cette lignée et a mis en évidence 3-1S, un mutant qui est déficient dans le relâchement du silencing à 37°C. Dans un premier temps, nous avons mis en évidence que le phénotype de 3-1S est dû à une mutation de RH35, une hélicase ARN à boîte DEAD. D’autre part, nos résultats montrent que le gène RH35 est exprimé plus fortement à 37°C et sa protéine présente, en outre, une relocalisation dans ces conditions de stress. RH35 serait, en fait, impliquée de manière plus globale dans le métabolisme des ARN en réponse au stress thermique et jouerait également un rôle dans la réponse au stress thermique et salin.

  • Titre traduit

    Study of DNA methylation regulation pathways and release of silencing after heat shock in Arabidopsis thaliana


  • Résumé

    In Arabidopsis thaliana, transcriptional silencing is associated with histone tail post-translational modifications and cytosine modifications in CG, CHG and CHH contexts (where H can be indifferently T, A or C). Numerous independent pathways lead to DNA methylation in all contexts through méthyltransférases. Conversely, the DNA demethylase ROS1 “prunes” methylation profiles and prevents genome hypermethylation. Interestingly, several mutants which are involved in DNA methylation pathways present a decrease in ROS1 gene expression, what reveals the existence of a negative feedback loop between DNA methylation and demethylation pathways. A genetic screening was carried out in order to find a ROS1 regulator. To do this, pROS1:GUS line, which carries the glucuronidase reporter gene under ROS1 promoter, was used. In the nrpd1a-4 mutant, ROS1 and glucuronidase genes are underexpressed. The screen consisted to find a mutant which release glucuronidase and ROS1 gene expression in nrpd1a-4 mutant background. Six mutants presented a higher expression of the glucuronidase than the pROS1:GUS control in nrpd1a-4 background. However, unlike what it was expected, endogene ROS1 expression is even lower than what we have for pROS1:GUS in nrpd1a-4 background.In view of these results, the thesis was redirected toward the study of the silencing circumvention pathway of the repeated elements. Indeed, when heat stress at 37°C during 24h is applied, a release of silencing is observed for repeated elements. Nevertheless, no known epigenetic modifications seem to be involved. To study this phenomenon, we used a L5 line. Its transgene is silenced in standard conditions. Because L5 construct is composed by several glucuronidase repetitions under 35S promoter, it is considered as any other repeated elements and, for this reason, it is also expressed after heat stress. The team performed a genetic screen on this line and found 3-1S, a mutant which is deficient in the release of silencing at 37°C. On the one hand, we demonstrated that 3-1S phenotype is due to a mutation in RH35 DEAD box RNA helicase. On the other hand, our results revealed that RH35 gene is expressed at 37°C and its protein is relocated in heat stress conditions. In fact, RH35 would be involved more globally in RNA metabolism and would play a role in heat and salt stress.


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