Mécanisme, maturation et biodiversité d'une enzyme à cofacteur NiFe, importante dans le contexte de l'énergie et de l'environnement : la carbone monoxyde déshydrogénase

par Meriem Merrouch

Thèse de doctorat en Océanographie

Sous la direction de Sébastien Dementin et de Pierre-Pol Liebgott.

Le président du jury était Jalila Simaan.

Le jury était composé de Petra Hellwig, Corinne Aubert-Mammou.

Les rapporteurs étaient Béatrice Golinelli-Pimpaneau, Vincent Nivière.


  • Résumé

    Les CO-Déshydrogénases (CODH) catalysent l’oxydation réversible du CO en CO2. Le site actif des CODH isolées d’organismes anaérobies est constitué d’un centre [Ni-4Fe-4S]. La CODH contient 3 autres centres Fer-soufre dont un est à l’interface entre les deux monomères. Nous avons étudié différents aspects de la réactivité de CODHs provenant de divers micro-organismes : leur fonction physiologique, la maturation de leur site actif, leur mécanisme catalytique et leur réactivité vis-à-vis de l’O2. Ces enzymes sont réputées être « extrêmement » sensibles à l’O2, cependant le mécanisme d’inactivation par l’oxygène n’est pas connu. Nous avons étudié par électrochimie directe l’effet de l’oxygène sur différentes CODHs et montré que l’oxygène inhibe rapidement le site actif, mais qu’il est possible de réactiver l’enzyme partiellement ou totalement après réactivation.Afin de caractériser la chaîne de transfert d’électron de la CODH de Desulfovibrio vulgaris Hildenborough, nous avons analysé par des approches biochimiques, électrochimiques et spectroscopiques différents mutants de la CODH. Nous avons, par mutagénèse dirigée, modifié le centre [2Fe-2S] interfacial soit pour le convertir en centre [4Fe-4S] soit pour l’éliminer complètement.Pour comprendre la fonction de la protéine accessoire CooC dans la maturation du site actif de la CODH de Desulfovibrio vulgaris Hildenborough, nous avons entrepris différentes approches pour produire cette maturase et nous avons comparé les structures cristallographiques des CODHs produites en présence ou en absence de la maturase. Nos données sont cohérentes avec les résultats obtenus précédemment : CooC est nécessaire à l’insertion du nickel.

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  • Résumé

    CO-dehydrogenases (CODH) catalyze the reversible reduction of CO2 to CO. CODH are homodimeric enzymes which contain a [Ni-4Fe-4S] active site and three iron-sulfur clusters, among which one is at the interface of the two monomers. We studied various aspects of CODH from different micro-organisms, including their physiological function, maturation of their active site, their catalytic mechanism, and their reactivity with O2. CODHs are deemed to be “extremely” sensitive to O2. However, no studies related to the mechanism of inhibition of CODHs by O2 have been conducted so far. We use protein film voltammetry to study the effect of O2 on different CODHs and we have shown that CODHs are strongly inhibited by O2 but that the inactivation can be partially or completely reverted by reduction. Moreover, the extent of reactivation varies from one CODH to the other. To characterize the iron sulfur clusters chain of CODH from Desulfovibrio vulgaris Hildenborough, we studied by biochemical, electrochemical, and spectroscopic approaches, different mutants of CODH. By site-directed mutagenesis, we modified the [2Fe-2S] cluster at the interface of the two monomers to converted it to a [4Fe-4S] cluster or to deleted it altogether.To understand the function of the accessory protein CooC in the maturation of the active site of CODH, we used several approaches to produce CooC from Desulfovibrio vulgaris Hildenborough and compared the crystallographic structures of CODH produced in absence or in presence of CooC. Our data are consistent with those previously obtained: CooC is essential for nickel insertion into the active site of CODH.

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